文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
光动力联合反义寡核苷酸影响bcr-abl阳性k562细胞生长的实验
研究
姓名:张林
申请学位级别:硕士
专业:康复医学与理疗学
指导教师:虞乐华
20040501
第三军医大学硕士学位论文
光动力联合反义寡核苷酸影响阳性
细胞生长的实验研究
摘要
目的白血病是当前我国最常见的肿瘤之一在儿童和青少年的恶性肿瘤中
白血病则占第一位化疗或放疗仅可使一部分病人的症状得到缓解造血干细胞移植
使治愈白血病成为可能由于供受者之间的配型的相合性和年龄等问题同种异
体造血干细胞移植的广泛应用受到限制自体造血干细胞移植 autologous
hematopoietic stem cell transplantAHSCT 为不能进行异基因造血干细胞移植
allogeneic stem cell transplantAllo-SCT 的病人带来了治愈的机会但 AHSCT面
临一个严峻问题即移植后肿瘤的高复发率而移植物中残留的微量肿瘤细胞克隆增
殖是其复发的主要原因因此有效清除移植物中残留的肿瘤细胞已成为当前一个重
要研究课题近年来随着光动力疗法(photodynamic therapy ,PDT)相关技术的快速
发展尤其是第二代光敏剂的出现使得光敏剂在肿瘤细胞中具有更高的选择性聚集
能力吸收波长更长产生更大范围内的杀伤同时它的光毒性极小因而副作用小
在净化骨髓移植物中显示出较强的实用价值反义技术是基因治疗的一种方法其原
理是反义寡核苷酸与靶的 mRNA 序列专属性结合并抑制基因表达大多数肿瘤细胞
的基因表达形式与正常细胞不同理论上反义寡核苷酸能被用于专属地靶向肿瘤相关
基因或变异基因而不影响正常细胞的基因表达因而使反义技术在净化骨髓移植
物中也显示出良好的应用前景近来随着基于 PDT 发展而来的光化学基因转染
(photochemical gene transfection, PGT)新技术的逐步完善反义寡核苷酸的细胞内转
染得到明显增加从而为反义寡核苷酸有效发挥其抑制基因表达的作用提供了有利条
件 Bcr-abl 融合基因是慢性髓细胞性白血病 chronic myelogenous leukemia CML
来源的 K562 细胞株的标志基因,它由人 22 号染色体上 bcr 基因易位至 9 号染色体上
的 abl 基因而形成即 t(9 22) 在细胞遗传上表现为特异的 ph 染色体该融合基
因可以在 95%以上的 CML患者中检测到而正常人缺如且其编码的 P210bcr-abl 蛋白
在 CML 发病中起着决定性作用 P210 是 CML 细胞生长的一种内在刺激物而且还
可能通过 GRB(growth factor receptor bound protein-2)与 ras 信号途径发生偶联造成
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细胞错误或过多传递信号使细胞出现恶性增殖而凋亡减少本实验中我们观察 PDT
联合反义寡核苷酸体外对 K562 细胞生长的影响目的是探讨 PDT 和反义寡核苷酸
的联合应用是否协同干预 K562 细胞生长为研究净化自体骨髓移植物的新途径提
供实验基础
方法 1 细胞培养人 CML急性变 K562 细胞株常规在 RPMI1640 培养液(含
10%灭活新生小牛血清)中培养 2 实验分组 1 HMME-PDT 对 bcr-abl 融合基因
反义寡核苷酸 K562 细胞转染影响实验分为 2 组 A 组实验组加入 HMME 荧
光标记的 AS ODN 孵育 6h,激光照射 B组对照组加入 HMME 荧光标记的 AS ODN
孵育 6h,不用激光照射其中荧光标记的 AS ODN 加样浓度分为 4 个梯度(
mol L-1 mol L-1 mol L-1 mol L-1),HMME浓度为 20 g ML-1
激光照射剂量为 9 J·CM-2 (2)HMME-PDT 联合 AS ODN 影响 K562 细胞生长体外实
验分为 8 组 A 组正常对照组(不加 HMME 反或错义寡核苷酸孵育 6 小时不用
激光照射) B 组光敏剂对照组(仅加 HMME孵育 6h,不用激光照射) C 组激光组
不加 HMME 反错义寡核苷酸孵育 6 小时单纯激光照射 D 组光动力组(仅
加 HMME 孵育 6h,激光照射) E 组错义组仅加错义寡核苷酸孵育 6h,不用激光照
射 F 组反义组(仅加反义寡核苷酸孵育 6h,不用激光照射) G 组光动力+错义
组加 HMME 错义寡核苷酸孵育 6h,激光照射 H 组光动力+反义组加 HMME
反义寡核苷酸孵育 6