文档介绍：山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
PAT 家族蛋白是脂肪滴(lipid droplet,LD)表面主要结构蛋白,在脂肪代谢过程中
具有重要的作用,参与脂滴的合成、分解和转运过程。目前,关于 PAT 家族蛋白的研究
主要集中在哺乳动物中,而在昆虫中的报道很少。在哺乳动物中发现的 PAT 家族蛋白成
员包括脂滴包被蛋白(perilipin)、脂肪分化相关蛋白(ADRP)、47kD 的尾连蛋白(TIP47)、
S3-12 和氧化型 PAT 蛋白(OXPAT)。昆虫的基因组只能编码两种 PAT 家族蛋白,即脂
肪储存小滴蛋白 1(LSD-1)和脂肪储存小滴蛋白 2(LSD-2)。LSD-1 作为昆虫脂滴表
面重要的 PAT 家族蛋白直接参与脂肪代谢的调控。本文以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)
为实验材料,首次从中华蜜蜂中克隆得到 LSD-1 基因(AccLSD-1),并对其进行了序列
比对,表达特性分析及初步功能鉴定,为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定了基
础。主要研究结果如下:
1、利用RT-PCR和RACE-PCR的方法,首次从中华蜜蜂中克隆得到了LSD-1基因,
LSD-1。并将该基因在Genbank注册,其注册号为GU722328。序列分析结果表
明,AccLSD-1cDNA全长为1313 bp,包括1161 bp的开放阅读框(ORF),40 bp的5′非编
码区(5′UTR)和112 bp的3′非编码区(3′UTR)。该基因编码一个386个氨基酸残基的
多肽, kDa。通过同源性比较发现,中华蜜蜂LSD-1与其它昆虫LSD-1
的同源性很高。AccLSD-1含有昆虫LSD-1s家族所有的PKA磷酸化位点和脂肪滴结合位
点。进化分析表明,AccLSD-1与昆虫LSD-1聚集成簇,而与哺乳动物PAT家族蛋白的进
化关系较远。AccLSD-1基因组全长5224 bp,包含8个外显子和7个内含子。其中,内含
子1位于5′UTR内,推测该内含子可能具有特殊的功能。
2、通过 LA-PCR 和I-PCR 的方法获得 AccLSD-1基因的启动子序列。利用分析软件
TFBIND 对其进行分析,发现该序列除了存在典型的 TATA box和 CAAT box外,还存
在多个响应脂肪代谢的特殊作用元件,如PPARγ响应元件和C/EBPα元件。另外,还发现
了几个响应环境应激的作用元件,如热响应元件和T细胞响应元件。
3、利用Real-time PCR的方法,LSD-1在不同发育时期mRNA水平的表达
情况。研究表明,AccLSD-1在中华蜜蜂的整个发育过程中均有表达。在幼虫时期(3日
龄至5日龄),AccLSD-1表达量随日龄的增加逐渐升高。在成虫时期,AccLSD-1在25日
龄青年蜂的表达量明显高于2日龄幼蜂和50日龄老年蜂的表达量。然而,LSD-1
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中华蜜蜂(Apis cerana cerana) LSD-1 基因的克隆及其表达特性分析
表达呈现抛物线的趋势且在Pb时期有最高表达量。同时还发现在中华蜜蜂蜕变时期(无
论是幼虫蜕变成蛹还是蛹蜕变成成虫)AccLSD-1的表达量都明显降低。
4、利用室内人工饲养的方法,LSD-1在不同浓度的共轭亚油酸或罗格列
***诱导下mRNA水平的表达情况。结果表明,AccLSD-1转录水平受罗格列***的诱导而升
高,LSD-1的表达量。与只添加共轭亚油酸组相比,同时添
LSD-1的表达量。
5、LSD-1中选取N端600氨基酸片段构建原核表达载体pET- AccLSD-1-600,
并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS中获得抗原,
并免疫小鼠制备抗体,其抗血清效价为1:2000。
LSD-1基因的结构特征,并进行了功能预测。根据试验结果,我们
LSD-1在中华蜜蜂蜕变发育,尤其在蛹的发育过程中发挥重要作用,且共轭亚油
LSD-1表达。
关键词:中华蜜蜂;LSD-1;基因克隆;表达分析
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山东农业大学硕士学位论文
Cloning and functional analysis of of a novel LSD-1 gene,
AccLSD-1, from Apis cerana cerana
Abstract
PAT family proteins, the major structural proteins located in the coat of lipid droplet
(LD), play an important role in lipid metabolism and a