文档介绍：背景
据估计,人体中大约总共可产生500,000种蛋白,而单个细胞可以产生 10,000 种。
在这些蛋白中,80%不是以独立的方式存在的,而是存在于一个蛋白复合体中。
蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中,我们形象地称之为通过节点(nodes)连接的枢纽(hubs)。
蛋白的相互作用
Standard Techniques
Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins
Affinity Tags
Tandem Affinity Purification (TAP) Tags
Strep-Tag III
Quantitative Proteomics
Chemical Crosslinking
Two-hybrid Yeast
Phage-display
Universal Verification of Interaction Techniques
Co-Immunoprecipitation
Confocal Microscopy
Biophysical Verification of Interaction Techniques
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM)
Mass Spectroscopy (MS)
Atomic Force Microscopy (AFM)
Surface Plasmon Resonance (SPR)
实验目的
学****并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法,了解免疫共沉淀结果分析。
了解与免疫共沉淀相关的实验及进展
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。金标准
用途:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
概念及用途
binding
wash
elution
Y
Y
Y
Y
Y
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 x 的抗体免疫沉淀 x,那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也能沉淀下来。
实验原理
人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿,培养大约90%以上融合后,倒掉培养液,PBS洗3次;
加入1ml Lysis Buffer(20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM β-Glycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase,pH ),冰上放置30min,裂解细胞;
实验步骤
采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(%SDS)。
为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。
Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。
将裂解液转移至EP管中,4℃转鼓摇15min ,14000g 4℃离心15min ;
吸取上清液到新EP管中,每管加1μg 对照兔IgG,同时加入Protein A agarose,4℃转鼓转30min,4℃ 10000g 离心5min;
preclear及其作用
一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和protein A-agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A-agarose非特异结合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
转移上清液至一新管中,将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g,用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l,4℃转鼓过夜(10min);
孵育液体积的控制:考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。
加入35 μl Protein A ag