乳糖酶基因.doc

文档介绍：生物技术084 张权 20080134404
基因工程在乳糖酶基因方面的具体应用
乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质,还含有免疫球蛋白等抗病因子,易被人体消化吸收,是人类改善营养、增强体质的理想食品。除此之外,在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物,对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效,特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质,与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而,人体却不能直接利用乳糖,它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现,世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏,东方人乳糖酶缺乏高达85%,从而导致“乳糖不耐症”的发生。
    乳糖酶(,又名β半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷的转移作用[3]。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂,能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中,大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中,以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而,不同来源的乳糖酶,其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。
    1  材料与方法
      材料
      菌株与质粒  保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α由本室保存;pGMT vector购于北京天根生化科技有限公司。
      试剂材料   细菌培养试剂购于Sigma公司;引物由上海生工合成;LA DNA聚合酶购于自大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、DNA Ladder购于北京天根生化科技有限公司;T4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。
      方法
      保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA的提取
    用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌,并划平板到MRS固体培养基,37 ℃培养72 h,挑取单个菌落于MRS液体培养基进行增菌(37 ℃摇床)。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。
      引物设计与合成  从GenBank数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列(GenBank序列号:GI149564)设计引物如下:P1:5'5' GCGATG AGC AA TAAGTTA3';P2:5'CCGCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG3'。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为BamH I和Xho I酶切位点)。
      乳糖酶基因的PCR扩增与鉴定  反应总体积为25 μL:模板DNA(1 μg/μL) 3 μL,10× μL,Mg2+( 25 mM) μL, dNTP( mM) μL,引物P1(10 pmol/μL) μL,引物P2 (10 pmol/μL) μ