文档介绍：植物总DNA提取方法
赵红
(山东师范大学生命科学学院)
摘要:利用液氮研磨植物幼芽,以苯酚——***仿——异戊醇——核糖核酸酶法提取了大豆、菜豆、玉米等几种作物的总DNA。所提取的DNA经紫外线分光光度计(牌子未知)%的琼脂糖凝胶电泳,结果证明:该方法提取的植物总DNA纯度高,片段长度整齐,约有50Kb左右,并且DNA收率很高。
关键词:DNA提取;纯度;收率
近几年来,外源总DNA通过花粉管道直接导入农作物在多种植物上得到广泛的应用【】,我们采用外源DNA直接导入大肠杆菌多年,该技术对DNA纯度有很高的要求。都必须要求提高纯度和大小要求整齐度。
本文将讲述利用苯酚——***仿——异戊醇——核糖核酸酶法提取几种植物总DNA的方法及其结果。
材料和方法
(一)大豆、菜豆、玉米等3种作物共约30份材料。
(二) 提取方法
1、取暗发芽的植物幼芽30g ,在液氮预冷的研钵中与液氮混合研磨成粉末状,加30ml提取缓冲液[4] ,℃水浴30分钟,冰浴分钟。
,轻轻摇匀,-20℃冰箱冻存5一10 分钟,4000r/min离心5分钟,吸出水相。
3、加等体积苯酚一***仿一异戊醉(25:24:1),摇匀,
4000r/min离心5分钟,吸出水相。
4、加等体积***仿一异戊醇,摇匀,4000r/min离心5分钟,吸水相。
5、约2倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA,用玻璃棒绕出或离心沉降,得到DNA粗制品,略凉干。
6\用 *SSC将沉淀的DNA溶解后加1/10体积的10*SSC ,使其最终浓度达1*SSC,JIA RNA酶,使酶的最终浓度达50一75微克每毫升37℃水浴保温40分钟。
7、重复2、3、4 程序。
8、 A,离心DNA沉降,弃去上清液,略凉干,得到精制DNA。
9、*SSC溶解后,加1/10体积的10*SSC 。
然后用紫外分光光度计检测所提取的DNA纯度及收率,%的琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度是否整齐一致.。
结果
1、该方法与***仿一异戊醇法所提取的这几种作物DNA经紫外分光光度计检测结果如表格
从表可以看出:本方法所提取的几种作物DNA均为A260/A230>;A260/A280>,表明DNA纯度符合质量标准,%,(—%),而第二个表格所示用***仿——异戊醇法提取的DNA多数不符合标准。
2、该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,其片段长度为50Kb左右,可见提取效果很好,片段长度大小一致,RNA以去除干净,并且没有DNA大量降解的情况。
3、DNA的收率,经紫外分光光度计的260nm处得光吸收值可以计算出DNA收率=(/L*稀释倍数*原液体积
L为比色杯首都;;。
经此公式计算该方法提取的DNA均在80---100微克每克植物幼芽鲜重。
经紫外分光光度计的扫描结果可以看出是明显的DNA紫外吸收特征【5】
讨论
1、本实验采用饱和苯酚—异戊醇去除组织蛋白,其效果比单纯***仿异戊醇去除组织蛋白好得多。主要由于低温下饱和苯酚与组