文档介绍：分子克隆 (基因工程)
周坤福 **********
zhoukunfu@
前言
二十世纪40年代,基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA,而不是蛋白质
50年代,Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制
深刻意义在于:解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题
50年代末和60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,并成功破译了遗传密码。
从而阐明了遗传信息的流向和表达问题
DNA mRNA 蛋白质
转录
翻译
tRNA,rRNA
逆转录
复制
这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础
基因工程的诞生
70年代初,DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。
1972年,(一种猴病毒)的DNA和噬菌体DNA分别切割,又将两者接在一起,成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。
1973年,Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中,成功地进行了无性繁殖,从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。
基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。
基本概念
基因工程的核心是重组DNA技术(binant DNA technique),又叫DNA克隆(DNA cloning)。
所谓克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
在基因工程中所指的克隆,是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组,并将重组分子导入适合的宿主细胞,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得该DNA分子的大量拷贝。
基本概念
这类克隆是在分子水平上操作,故又称分子克隆(molecular cloning)。由于研究对象常常是特异的基因片段,所以又称作基因克隆(gene cloning)。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程(ic engineering)。
基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。
细胞克隆技术:在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。
哺乳动物的克隆:克隆概念在个体水平上的应用
采用了核质分离、细
胞融合、体外培养及胚胎移植等技术
主要内容
①从复杂的生物有机体基因组中,分离出目的基因片段。
②在体外,将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上,形成重组DNA分子。
③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称宿主细胞),并与之一起增殖。
④筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
⑤从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段,供进一步研究使用。
⑥将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之实现功能表达。
应用实例
重组DNA技术跨越天然物种屏障,将原核和真核生物,植物和动物,细菌和人,动物和人的基因连接起来,进行基因交流。
利用大肠杆菌()、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的,从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。
1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物——人胰岛素上市( 1979年美国基因技术公司)