文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
牛催乳素基因在乳腺组织中特异性表达的研究
姓名:曹新
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:曾溢滔
牛催乳素基因在乳腺组织中特异性表达的研究第—部分牛催乳素基因克隆和鉴定中文详细摘要甪确的。,使之具有较高的生物活性,同时产奶量大,易于大规模的生ü;蚨锏娜橄偕屑壑档囊┪锏鞍资且┪锷囊恢中履产,因而成为乳腺生物反应器研究的理想的动物模型。目前,已经培育出了用于生产药用蛋白的转基因绵羊,山羊,猪和牛等转基因家畜。与传统的制药方法相比,应用转基因家畜生产药物具有污染少、效益高的优点,代表了生产药物蛋白的理想途径。彳催乳素,是脊椎动物腺垂体分泌的单链多肽类激素,的靶基因ㄍ庠椿的表达。奶牛是具有重要经济价值的大型家畜,选动物,通过牛催乳素和转基因技术的研究来改进或增强奶牛泌确⑾峙O俅固宓奶崛∥锬芄灰鸶肜噜寄疑长和刺激嗉乳的进一步加工以及可使假孕兔乳汁的分泌。人们开始认识到在牛腺垂体溉槎锵俅固存在着一种后来被命名为催乳素的物质,并于因的克隆定位,但有关利用牛催乳素基因来构建转基因动物一乳腺生物反应式。一般的做法是采用乳蛋白基因的启动子来使外源基因限制在转基因动物的乳腺中表达。牛羊等大型家畜因其生理机制与人类相似,能对药用蛋白进它的广泛的生物学功能特别是与哺乳动物的乳腺发育,乳汁生成,发动和维持泌乳直接相关。催乳素作用的分子机理,是通过一系列信号传递途径来作用于乳蛋白基因的启动子,从而启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用它良好的生长优势、生理特点是构建转基因受体和制备乳腺生物反应器的首早在年,六十年代和八十年代分别实现了对一些哺乳动物催乳素的分离纯化和相应基器的研究尚无文献报告。查询除仅见几个不连续片断外,至今无乳的质和量,意义重大。催乳素基因组全序列的报道。上海第二医科大学博士学位论文
.泶镌靥逦;镜墓菇ǹ蚣埽肨用刚龆銎我淮斡第二部分乳腺组织特异的表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达本论文的第—部分研究工作包括:#產调控序列启并证明了本文克隆的基因在体外培养的细胞中能够在转录水平进産颍庑蚪峁允荆诟没虻牡、痈鞔嬖谝桓黾罨的错义改变,实验证实,这系过程中碱基错配而造成。为此,我们在的基因组、的相应序列进行了碱基回复突变。蚭与含山羊业鞍肛τ靡压ú伎墒褂玫娜蝏蛄校杓屏巳猿ぞ嗬隤,,体外转染哺乳动物真核细胞通过,将获得的扩增片段构建克隆。测序结果证明已成行表达。限制性片段长度多态分析技术和测序结果证明回复突变是成同错配位点的及克隆子。为进一步对催乳素基因表达调控的基础研究和建立转基因动物一乳腺生物反应器奠定了重要的基础。为了使基因在乳腺组织中特异表达,本文的第二部分研究工作包蚱舳’端上游调控序列共的蛄辛印R琧的乳腺组织特异的真核表达载引物,成功地扩增全长约的基因组序列,测序结果证实成功克隆了基因组全序列。功地克隆了包括所有编码阅读框,长度为膃蛄校功的,而其它的序列维持不变。由此获得编码序列完全正确的和具有不ǹ寺〉腷动基因A嘶竦猛暾腷括:体。上海第二医科大学博士学位论文
第三部分转基因小鼠的研究A颂教諴对乳蛋白基因表达调控的作用以及对以乳蛋白基因启动子为调控元件的其它外源基因表达的影响,ü獾鞍孝艮止基因基因的序,结果显示基因乳腺特异表达载体的构建是正确和合理的。用脂质体包埋通过尾静脉注射哺乳的母鼠,经瞬间表达后,,形成具有两个表达单元蚳墓脖泶镌靥濉的乳腺特异表达载体中,装入绿色荧光蛋白对上述已经构建的表达载体进行酶切鉴定及分别在序列间的接头处测ü菇ǖ娜橄偬匾斓谋泶镌靥澹直鹱H綜细胞株侵蘼堂ê’睁细胞虷细胞株∈笕橄偕掀は赴,,通过实验,证实转染的细胞中在水平均获得了表达。用人催乳素单抗进行定,虽未检测到,。从上述结果可间接地证明或推测本文构建的基因在真核细胞中能够表达皇亲魑D诜置诩に仄浔泶锝系停并具有生理活性。。将该表达载体腺细胞中有明显的荧光亮点,说明癰蛟谌橄僮橹谢竦了有效的表达。表达载体。控序列启动上海第二医科大学博士学位论文、
的转基因小鼠弧H淖;蛐∈只,带有卵管内,使发育、妊娠共产仔只。至今对子一代鼠经癝分析共得到恍鴅虻脑;蛐∈后期制备的转基因小鼠正在不