文档介绍：生物化学实验预****报告
实验三酵母核糖核酸的提取及测定
一、研究背景
RNA(核糖核酸)普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内,是遗传信息的载体,由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能,属酸性高分子化合物,参与蛋白质生物合成,调控基因表达,作为核酶催化生化反应活性,对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外,由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能,[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料,经加工制成的产品,主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前,人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品,需求量日益攀升,RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面,具有广阔的商业前景,形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用,都面临一个问题:RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起,离体之后稳定性差、含量低,采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然,人们已经摸索出来了多种多样的方法,这些方法各有特点,但其基本的思路和程序大致相似,基本战略也是有规律可循的。另外,近年来RNA试剂盒的出现使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子也实现了可能。
二、研究目标
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三、研究策略
即选取富含RNA的生物材料,微生物由于其原料易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料。
提取RNA的方法有很多种,如浓盐法、稀碱法、混合盐法、苯酚法、表面活性剂法等[2],但在工业生产上应用最多的还是稀碱法和浓盐法。两种方法的原理不同,浓盐法是原理是在加热条件下,高浓度NaCl改变细胞膜的通透性,使RNA释放出来;稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解,释放RNA。两种方法各有特点,浓盐法的破壁率低,但提取的RNA纯度比稀碱法要高;稀碱法的破壁效果好,消耗时间短,能耗低,但提取RNA纯度较低,适于工业化生产。在实际中应根据具体情况及要求选择合适的方法。
提纯过程中常需要去除的杂质是蛋白质。通常采用等电沉淀法使RNA沉淀出来,使其与杂质分离,但有资料显示该法不能有效分离RNA和蛋白质,且RNA损失率较高。另外,也可使用盐析法、等电沉淀法析出蛋白质或蛋白酶降解法除去蛋白质。
测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法,定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。定磷比色法准确、微量、快速,是测定RNA含量的最好方法;戊糖测定法通过糖的颜色反应测定RNA,简单、快速,当样品中有粘多糖和蛋白质存在时会有干扰;紫外吸收法简单、快速、微量,但易受到蛋白质及含有共轭双键物质的干扰。
四、研究方案及可行性分析
本实验以食品用干酵母粉为材料,采用浓盐法提取核糖核酸并用紫外分光光度法测定制品中RNA的含量。方案合理,实验材料及器具实验室均可提供,时间上也允许,故本方案具有可行性。
五、具体实验设计