文档介绍：淋巴细胞转化试验(Lymphocyte Transformation Test, LTT)
[ 来源: 点击数: 278 更新时间: 2009年08月26日][ 收藏本文]
     T细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原(如植物血凝素 Phytohemagglutimin,PHA)或特异性抗原刺激后,可出现细胞体积增大,代谢旺盛,蛋白和核酸合成增加并能进行分裂,成为淋巴母细胞,即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之
一、形态学检测法
【原理】
淋巴细胞在有丝分裂原(PHA或ConA)或特异性抗原刺激下发生转化,产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等,由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率,了解机体的细胞免疫状态。
【材料】
Wright-Giemsa染液细胞培养液:多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌,临用前加入20%无菌NBS、PHA 50~200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)。
肝素(400单位/ml,用Hanks液配制), ml可抗凝血5 ml。
%碘酒、75%酒精。
载玻片、无菌棉签、无菌注射器5 ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。
【方法】
1.  灭菌器材  将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌, Mpa(15磅/吋2)20 min。
2.  分装培养液于各培养瓶中,每瓶2 ml。
3.   ml,无菌操作注入培养瓶内,立即摇匀,置37℃、5%CO2孵箱培养72 h,期间每天旋转摇匀1次,使细胞充分混匀。
4.  培养后,摇匀细胞,倒入离心管内,1000 r/min离心10 min。
5.  由于大的细胞离心后居上层者较多,只吸上层细胞推片计数,结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后,残留与管壁的少量液体回流至管底后,用毛细滴管吹打将管内细胞打散,置1滴于玻片上,用毛细滴管前端刮片,均匀分布于全片,染色,按头、体、尾三段各1~2纵列(计数走向似城墙形)进行计数,以减少分布不均带来的误差,每片计数100~200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数,求出转化率。
【结果】
1.  用形态学方法判断转化率,掌握淋巴细胞的形态学至关重要,应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染***、核结构和核仁的有无等特征进行判别。
⑴ 成熟的小淋巴细胞:与未培养的小淋巴细胞一样为6~8μm,核染色致密,无核仁,核与胞浆比例大,胞浆染色为轻度嗜碱性。
⑵ 过度型淋巴细胞:比小淋巴细胞大,约10~20μm,核染色致密,但出现核仁,此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
⑶ 淋巴母细胞:细胞体积增大,约20~30μm,形态不整齐,常有小突起,核变大,核质染色疏散,有明显核仁1~2个,胞浆变宽,常出现胞浆空泡。
⑷ 其它细胞:如中性粒细胞在培养72 h后,绝大部分衰变或死亡呈碎片。
,未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞,在正常情况下,PHA淋巴细胞转化率为60~80%,如为50~60%则偏低,50%以下则