文档介绍：实验四蛋白质含量的测定
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1. 了解Folin酚法(Lowry法)和考马斯亮蓝G250法(Bradford法)的基本原理。
2. 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的基本操作。
3. 学会使用722型分光光度计的使用方法。
【目的和要求】
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Folin酚法( Lowry protein assay )
【实验原理】
福林酚法试剂
包含两部分
试剂甲:Na2CO3、 NaOH、CuSO4 及
酒石酸钾钠组成
试剂乙:磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴组成
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蛋白质
(肽键)
Tyr
Trp
Cys
Folin酚甲Cu2+ Cu+
测定范围约在25-250μg / ml 蛋白质。
钼蓝和钨蓝
Folin酚乙
(650nm处比色)
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测定范围1-100μg / ml蛋白质。
蛋白质+
考马斯亮蓝
深蓝色化合物
(595nm处比色)
(Arg, 疏水性氨基酸)
考马斯亮蓝G250法(Bradford protein assay)
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Modified Lowry
o Range: 25-250μg / ml
o Accuracy: Good
o Convenience: Fair
o Major interfering agents: Strong acids, ammonium sulfate
Bradford assay
o Range: 1-100μg / ml
o Accuracy: Good
o Convenience: Excellent
o Major interfering agents: None
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A或OD :光吸收(absorbance)或光密度(Optimal Density)
:摩尔消光系数
C:样品摩尔浓度
l:比色杯的内径长度
I0:入射光强度;
I :透射光强度;
T (transmittance): 透光率( I1 / Io )
A=Lg( Io/I1) = Lg(1/T)= C L
分光光度法测蛋白质含量-----Lambert-Beer 定律
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标准曲线法
根据Lambert-Beer 定律,颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。通过配制一系列不同浓度的标准蛋白,测定特定波长下的吸光度值, 制作标准曲线。
根据样品的吸光度值,计算蛋白质浓度。
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Spectrophotometer分光光度计(722型)的使用
开盖预热
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调节波长
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