文档介绍：5光密度分析
本小节的教学目的是引领您了解Image-Pro Plus的光强度校准和分析工具。
在本练习中,您将:
装入一幅凝胶示例图像并以光密度为条件来校准图像的强度标。
从凝胶图像内的像素带获得光密度测量。
建立一个入射光的基线测量。
逆着入射光基线绘制DNA像素带的密度测量。
捕获绘制的屏幕图像。
存储到一个图像文件中以便于其它应用程序导入。
本练习大约需时15分钟。
设置:如果您还未启动Image-Pro Plus,请先启动。当启动了Image-Pro Plus后,您即可按照下述操作步骤进行练习。
重要:请为此次练习检查您的Image-Pro设置是否与本教学中对话框上的设置完全相同。如果Image-Pro ,则Image-Pro 。
装入图像
在本练习中,您将修改Image-Pro Plus的强度标,从而将DNA凝胶示例图像的光强度值表示成光密度值(校准为一个标准的光密度曲线)。本图像是使用CDD照相机在光盒中拍摄的,在样例的后面有UV(紫外线)光源。
1.
从Image-Pro 。
DNA带
空带
。暗条纹(带)表明存在DNA。
2.
从测量菜单中选择校准次级菜单,然后选择强度命令。
出现强度校准- 。
3.
点击新建按钮以创建一个新校准。
出现强度曲线并且在名称字段中出现Intensity Cal 0的名称。
X轴代表原始强度值
Y轴代表已校准值
名称字段可标识您将要创建的校准值的设置。您可将校设置保存下来,以便您再次需要时可方便地调用。
强度曲线以图解的方式说明了强度标上校准发生变化时的效果。X轴描述的是原始的强度值(如,从图像上读取的值),而y轴则反映了每次校准所发生的变化。
4.
输入UV Light作为新校准的名称。
5.
输入OD作为光密度的单位名称。
X轴代表光强度
Y轴代表光密度
6.
点击标准光密度旁的单选按钮。
强度曲线的变化可反映出密度/强度间的关系。
光密度刻度反映了传输材料内光的衰减指数。正如您所看到的,光密度曲线与光强度刻度呈现出的是一个逆向关系。这意味着:
小的光强度值对应大的光密度值。
大的光强度值则对应小的光密度值——例如,像素越暗,则材料越密集。
继续本练习的下一个步骤:指定黑色和入射色阶。
指定黑色和入射色阶
在本练习中,您将建立反映黑色(表明不存在光)和光入射或白色(表明不存在材料)的色阶。
在图像左上角的黑色圆形对象(黑点)是校准标准,将使用它来建立黑色色阶。此对象反映出了当没有光线通过它时,照相机所记录的光强度。当在光盒中用照相机进行拍摄时,在样品上贴了一个实心物体从而创建了此对象。
在左侧的空白区域将用于建立入射级别或白色色阶。此区域反映了不存在材料时所记录的光强度,并且所有可能的光线都通过了照相机。
您现在可输入级别值,或者点击相应的图像按钮以交互式地设置色阶。
1.
点击光强度校准对话框中的选项按钮。
出现光密度校准对话框。
2.
点击黑色色阶组框中的图像按钮。
出现黑色色阶消息框,同时在图像上,光标变成了十字光标。
3.
移动十字光标到左上角处的黑点上。当十字光标的中心位于黑色圆形的中心上时,点击鼠标左键,此时黑色色阶消息框中的读数变为8。
再次出现光密度校准对话框,并且黑色色阶字段的数字变为8。
4.
点击入射色阶组框中的图像按钮。
出现入射色阶消息框。光标变成了十字光标。
5.
移动十字光标到图像左侧的空白区域。点击鼠标左键,同时入射色阶消息框中的读数变为121。
再次出现光密度校准对话框,并且入射色阶字段的数字变为121。
6.
点击确定按钮。
出现强度校准- 。密度曲线的两个端点反映了您刚刚输入的黑色和入射色阶。
7.
点击确定按钮。
将关闭强度校准- 。
继续本练习的下一个步骤:绘制带密度。
绘制带密度
在本练习中,您将要收集凝胶中一个DNA带的光密度测量,并使用谱线轮廓命令绘制出它的光密度。谱线轮廓可绘制图像上一个直线中每个像素的值。在本练习中,您将要定义一列像素(不是一条单一直线),然后沿着此列的长度绘制“平均”光密度值。
1.
从测量菜单中选择谱线轮廓命令。
出现谱线轮廓- ,。
注意:在本练习中,一些示例图像会以图表方式显示轮廓的统计值。在您的计算机中,这些统计可能不