文档介绍：分光光度法测定发酵液中还原糖含量
一、实验目的
二、实验原理
三、实验仪器材料
四、实验操作步骤
五、实验结果
六、实验思考题
实验指导
1、实验目的
1、理解可见分光光度法测定还原糖的目的和意义;
2、掌握可见分光光度法测定还原糖的原理和方法;
3、掌握几种型号的紫外、可见分光光度计的操作方法。
2、实验原理
根据糖分的还原性的测定法,叫做还原糖法。此法可用来测定葡萄糖、果糖、麦芽糖和乳糖等还原糖。蔗糖和淀粉等许多碳水化合物,须经过水解后再用还原糖法测定。
主要的还原糖测定方法有:
兰-埃农法:将样品滴加到一定量、沸腾着的费林试液中,用***兰为指示剂,滴到它恰好褪色。
姆松-华尔格法:将样品试液与过量的费林试液反应,过滤取得生物Cu2O后,用直接称量法测知Cu2O的重量,然后在检索表中查到相当的糖含量。
缩合反应法:单糖与强酸加热产生糠醛或糠醛衍生物,然后通过显色剂缩合成有色络合物,再进行比色定量(包括酚硫酸法、蒽***法等)。
另外还有碘量,本实验主要DNS法,采用可见吸光光度法测定。
DNS法测定的原理
3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,用比色法测定。
3、. 实验仪器和材料
仪器:分光光度计、离心机摇床等。
试剂:无水葡萄糖标准溶液1mg/mL:称取于105℃,,加少量水溶解,移入100mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀;
DNS试剂:甲液: 100g/L的NaOH溶液中,并稀释到70mL,。乙液:称取255g酒石酸钾钠,加到300mL NaOH溶液中,再加入880mL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液,将甲液与乙液相混合即得黄色试剂,储存于棕色瓶中,室温下放置7天后使用。
4、实验操作步骤:
(1)葡萄糖标准曲线的绘制:准确吸取0、、、、、 mL 1mg/mL无水葡萄糖标准溶液分别置于6只25mL比色管中,并补水至2mL, DNS溶液,摇匀。于沸水浴中加热5min,取出,冷却到室温,用水稀释到25mL,在波长520nm,倒入1cm的玻璃比色皿中,以0号作空白,测定吸光度,以葡萄糖的毫克数为横座标,吸光度为纵座标,绘制标准曲线。所用试剂批号不同时应重作标准曲线。
(2)样品的测定:
样品的预处理:发酵液要经过离心沉淀后除去悬浮杂质,如有别的蛋白,多糖等干扰,可用淳沉法除去;
取1mL样品溶液,置于25mL比色管中,并补水至2ml, DNS 溶液,摇匀,于沸水浴中加热5min,取出,冷却到室温,用水稀释到25mL,在波长520nm,倒入1cm的玻璃比色皿中,以0号作空白,测定吸光度。
5、实验结果和计算
1、要求标准曲线要准确,。
2、要求被测样品的点要落在标准曲线上。
3、计算
还原糖含量(%)=M*50*1/1000*1/m*100
式中 M-由样品液吸光度从葡萄糖标准曲线查得葡萄糖质量(mg);
50-样品液的总体积(mL);
1000-mg换算成g;
M-称取试样质量(g)。
仪器
可见分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区:钨灯作为光源,其辐射波长范围在320~2500 nm。
紫外区:氢、氘灯。发射185~400 nm的连续光谱。