文档介绍：蛋白质含量测定
双缩脲法(Biuret法)
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实验目的
学****分光光度法测定的原理和方法
学****蛋白质含量测定的原理和方法
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
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实验原理
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物
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紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
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蛋白质测定方法:
双缩脲法(biuret法)
微量凯氏(kjeldahl)定氮法
folin—酚试剂法
考马斯亮兰法
紫外吸收法
总蛋白定量分析-BCA
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实验试剂与器材
(一)、实验试剂
1、标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,牛血清清蛋白用H2O %NaCl配制, NaOH配制。
2、双缩脲试剂
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(二)、实验器材
可见光分光光度计
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分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下,产生了对光吸收的效应,物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此当某单色光通过溶液时,其能量就会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系,也即符合比色原理——Lambert-Beer's law:
数学表达式: A=lg(1/T)=KCL A为吸光度 T为透射率,是投射光强度比上入射光强度 C为吸光物质的浓度 L为吸收层厚度 K为吸收系数物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.
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