毕赤酵母的摇瓶发酵方法.doc

文档介绍：毕赤酵母的摇瓶发酵方法:
摇瓶发酵方法:
毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段,1、酵母菌株生长阶段;2、脂肪酶诱导表达阶段。
酵母生长阶段。
准备试剂:1000ml BMGY培养基,1000ml BMMY培养基,10X的甲醇,摇瓶1L(灭菌),温控摇床,50ml离心管(灭菌)。紫外分光光度计,石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基,然后加入约1ml脂肪酶菌株(培养基:菌液=100:1),用透气膜封口(透气,但是细菌不能透过)。置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母生长,OD600=-,时间约为15-24小时。
将发酵液转入50ml离心管,1500g-3000g离心5min。去掉上清,用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=,约有500ml左右。将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中,每个摇瓶150ml发酵液(绝不能超过200ml)。
将摇瓶置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母表达脂肪酶,每24小时加入一次5%的甲醇,%。连续诱导表达48小时。
将发酵液进行12000rpm/min离心5min,取上清(若上清仍混浊,可反复离心);进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制(1000ml):20g蛋白胨(peptone),10g酵母提取物(Yeast Extract),加水至700ml;1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml,10X 磷酸钾缓冲液()100ml,10X甘油 100ml。
BMMY培养基的配制方法(1000ml):20g蛋白胨(peptone),10g酵母提取物,加水至700ml;1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml,10X 磷酸钾缓冲液()100ml,10X甲醇 100ml。
10X的甲醇的配制:取甲醇(AR 上海医药集团有限公司)5ml,加入无菌水95ml,配置成5%的甲醇溶液,(millipore公司)过滤除菌,该溶液在常温下的保质期为两个月。
10X的YNB配制方法(1000ml):称取YNB(生化试剂,上海生物工程公司,不含硫酸铵)34g,加入100g硫酸铵,待完全溶解后,(millipore公司)过滤除菌。该溶液在常温下的保质期可以达1年。
10X的磷酸缓冲液的配制方法:分别配制1M 的K2HPO4和KH2PO4,然后将132ml的K2HPO4和868ml的KH2PO4混合,;调PH用磷酸或者KOH,然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
10X的甘油的配制方法(1000ml):取100ml的甘油加水至1000ml,然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。
:在下是初学者,关于毕赤酵母的诱导表达有些问题:
+ E* v1 H  }0 A$ F3 s+ X       “每24h 向培养基中添加100% ~%”这里的甲醇浓度如何控制?
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