文档介绍：用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别
近年来的研究表明,Y染色体上锌指结构基因(zinc-finger-Y gene,ZFY)是继SRY之后又一与性分化有关的单拷贝基因,并与精子的发生有关[1,2]。为此,我们利用巢式PCR技术,以ZFY作为检测指标,参考有关文献自行设计内外两侧两对巢式PCR引物[3],对绒毛、羊水和孕妇外周血标本进行ZFY基因的特异扩增,初步建立了一种用PCR技术产前检测胎儿性别的方法。
1 材料与方法
标本
取正常男、女外周血各20份,。孕10~32周妇女外周血31份,每份6ml,流产胎儿绒毛45份,羊水40份,均为本科收治患者。分别采用绒毛染色体核型、羊水染色体核型、引产和出生胎儿***检查确定胎儿实际性别。
模板DNA的提取
外周血细胞DNA的提取
(
1)将6ml EDTA抗凝血离心5000r/min×3分钟后弃血清;(2)加入等体积破红细胞液〔,10mmol/L Tris-HCl(),5mmol/L CaCl2,1%tritonX-100〕充分裂解红细胞,离心5000r/min×3分钟,重复2次;(3)沉淀物加100μl白细胞裂解液〔50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(), MgCl2,%明胶,% NP40〕混匀后加入蛋白酶K5μl(30mg/ml),置50℃消化2小时,95℃加热10分钟,置-20℃保存备检。
绒毛及羊水DNA提取
参考文献[4]的方法,所有标本均进行巢式PCR扩增,随机取20例绒毛标本进行斑点杂交。
ZFY基因的引物设计及扩增
根据ZFY全基因序列,G+C比例和次级结构设计的巢式PCR实验用的外侧特异性引物选在ZFY基因区2125~2145位及2458~2478位,引物序列分别为P1:5′-A-3′,P2:5′-AACATCAGCTG-3′,扩增产物长354bp。内侧特异性引物选在ZFY基因区2149~2169位及2435~2455位,引物序列分别为:P3:5′-CTCTCAGT-TCACACAAAGG-3′,P4:5′-GCTTGTA-GACACACTGTTAGG-3′,扩增产物长307bp。上述引物经计算机模拟核酸杂交软件辅助分析与美国Gene Bank基因数据库比较表明,与人体基因组和其它生物基因组无明显同源性,引物碱基与靶基因一致,自身无发卡结构,无互补结构。PCR条件参数见本实验室已建立的HPV-PCR试验[5]。
斑点杂交
样品配制:DNA液20μl, NaOH, 20μl,20×SCC 40μl,混匀后加样于***纤维素薄膜上,使用PCR扩增片段内一段特异性寡核苷酸作探针,探针序列为:TTCATACAAA-TCATCGGTG,探针标记采用随机引物法,杂交步骤参见文献[4]的方法。
2 结果
扩增片段的序列分析
%低溶点琼脂糖凝胶回收354bp和307bp扩增片段,经Sephaglas band prep kit抽提后,乙醇沉淀干燥,参照Sequi Therm TM循环测序试剂盒说明进行Sanger双脱氧终止法“直接序列测定”[