文档介绍：Western Blot操作步骤
  一、 Western blot 实验步骤概述  二、 Western blot具体实验步骤
       三、 Western blot 实验注意事项  四、 Western blot关于内参抗体
                    一、 Western blot 实验步骤概述
1. 组织取材:组织块称重
2. 利用液氮、研钵粉碎组织块
3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA),PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃
4. 加入PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟
5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟
6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9. 沸水浴中3分钟
10. 上样
11. 电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA)
12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)
13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色
14. Westernblot 试剂盒显色
15. 分析比较记录
                    二、 Western具体实验步骤
    Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
                (Protein sample preparation)
    可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提。
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
                (Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
    SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理
    在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳