文档介绍：RNA 抽提指南(TRIZOL)
RNA抽提指南(TRIZOL)
警告:
有毒物接触皮肤或者不慎吞服。会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量
的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求苯酚和其他成分(NJTSRN
80100437-5000p)的正确治疗方案。
TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此,为达到最佳效果,我们建
议保存在2—8°C的环境下。
一般描述:
TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在破碎和溶解
细胞时能保持 RNA 的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA
存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后,样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能
析出中间层的 DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化 DNA 对于样品
间标准化 RNA 的产量十分有用。
无论是人、动物、植物还是细菌组织,该方法对少量的组织(50-100 mg)和
细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL
试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完
成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分
析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果
是用于PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用级联扩大的DNase I(Cat.
No. 18068)来处理抽提的总RNA。
TRIZOL 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA 的析出。例如,
从大鼠肝脏抽提的 RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于 7 kb
和 15 kb 之间不连续的高分子量条带,(mRNA 和 hnRNA 成分)两条优势核糖
体 RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量 RNA 介于 和 kb
之间(tRNA, 5S)。当抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值≥
预防RNA酶污染:
在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA
酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循以下
阮景明译仅供参考 1
RNA 抽提指南(TRIZOL)
指南:
* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提
并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪
器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶
A 或 T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可
能富含RNA酶。
* 在 TRIZOL 中,RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操
作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在
150°C 的烘箱中烘烤 4 小时。塑料器皿可以在 M NaOH 中浸泡 1