文档介绍：医学检验系临床免疫学教研室
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抗血清的制备
实验原理
在抗原刺激下可以使机体产生相应的抗体,由于抗体通常存在于血清中,因此也将机体受到抗原刺激后的血清称为免疫血清,免疫血清中含有对应于该抗原的多个决定簇的多种抗体—即多克隆抗体。
抗血清制备
实验原理
抗血清的制备分为三个步骤:
抗原的制备与纯化
动物的免疫(注射途径、注射次数、间隔时间等)
血清分离纯化与效价鉴定
抗血清制备
试剂与器材
抗原与免疫对象细菌菌种(伤寒沙门菌O901)、健康家兔。
试剂生理盐水、麦氏比浊管、石炭酸、防腐剂(%%硫柳汞)等
设备与器材剪刀、镊子、注射器、试管等器材和冰箱、离心机等设备
抗血清制备
实验方法
伤寒杆菌O抗原的制备
取经革兰染色做细菌纯度鉴定的伤寒沙门菌,密集划线接种于普通琼脂平板,37℃培养24~48小时;
用生理盐水将细菌菌苔洗于清洁、无菌的三角烧瓶中,置60℃水浴或隔水煮沸1小时使细菌的菌毛破坏(破坏H抗原);
抗血清制备
3. 将菌液移入离心管4000r/min离心10min,弃去上清,并用无菌生理盐水洗涤2次;
4. 取少量处理过的菌液再次接种于琼脂平板上进行无菌实验(37℃,24h),确定无活菌后用生理盐水调整菌液浓度至109个/ml,%,即为细菌O抗原。
实验方法
伤寒杆菌H抗原的制备
取有鞭毛的伤寒杆菌密集划线接种于普通琼脂平板上,37℃培养24~48小时;
取出培养板,用含有5%石炭酸(苯酚)的生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔,移入无菌三角烧瓶中,置37℃水浴24h(或4℃3~5天固定杀菌);
做无菌试验,用生理盐水稀释成10*9个/ml,即为细菌H抗原。
抗血清制备
免疫日期(天)
免疫途径
抗原
免疫剂量(ml)
1 ()
多点皮内
伤寒杆菌O或H抗原

6 ()
静脉
伤寒杆菌O或H抗原

11 ()
静脉
伤寒杆菌O或H抗原

16 ()
静脉
伤寒杆菌O或H抗原

19 ()
静脉
伤寒杆菌O或H抗原

实验方法
免疫方案
抗血清制备
实验方法
抗血清获取
试血:末次免疫7d后试血,试血一般耳静脉或心脏采血,分离血清与伤寒沙门菌O或H抗原做试验管凝集试验,凝集效价(滴度)在1:1600~3200之间时即可以放血,若效价较低,可继续加强免疫;
放血:采用心脏采血以获得最大血量,置37℃促进血块收缩,并用吸管吸取血清,3000r/min离心10min去除残余的红细胞。
抗血清制备
实验方法
抗血清的鉴定
效价的测定
效价的测定可根据抗体的不同性质,分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单项免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶免疫测定及放射免疫分析等方法进行测定。本实验以凝集反应为例。
抗血清制备