文档介绍：临床免疫学实验指导
检验医学院免疫学教研室
吴荣泉
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实验二、单向琼脂扩散试验
【实验原理】
将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板,打孔,在孔中
加入待测抗原,抗原可向四周呈辐射状扩散,当抗原,抗体在比例适宜时形成白色沉淀环. 沉淀环直径与抗原含量成正比。
用标准抗血清和已知浓度的抗原(或国际参考品)制成标准
曲线。通过测定样品沉淀环直径大小,可从标准曲线中读出抗原的含量。
本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等,具有高灵敏性,高特异性特点。
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【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用
【试剂与器材】
1. 羊抗人IgG血清(兔抗人血清,购买)
2. 标准参考血清(标准IgG质控物,购买)
3. 待检人血清(IgG—抗原)
4. PBS缓冲液(或NS)
5. 琼脂粉(制备1%免疫盐水琼脂液)
6. 载玻片、打孔器、 37℃恒温箱、湿盒、
可调微量加样器等
用于制作
标准曲线
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【操作注意事项】
1. 制备抗体琼脂板琼脂温度必须严格控制,温度
太低琼脂会凝固,太高则会影响抗体的活性
2. 加样孔内的琼脂应挑干净,切不可损坏孔的边
缘,确保每孔的液面基本一致
3. 加样精确,不能逸出孔外,否则结果不好观察
4. 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头
5. 检测过程中,标准曲线必须与样品同步操作
6. 孵育时间应控制在37℃,24-48小时,时间太短
或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。
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【标准曲线的制备】由实验教师
1. 购买标准已知浓度的人血清(IgG—抗原)
购买标准羊抗人(兔抗人) 抗人IgG--抗体(抗血清)
2. 制备1%盐水免疫琼脂凝胶板(在反面一角做好标记)
,加NS,,
放56℃,—,混匀,制板
3. 制板,打孔,孔径3mm,-,打5个孔。
4. 加样:在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10μL
1∶10, 1∶20, 1∶40,1∶80, 1 :160. 稀释
100 mg , 50mg , 25mg , ,. 浓度
5. 保温反应:将凝胶板放湿盒内,37℃反应24h,观察结果.
6. 用坐标纸制作标准曲线:以沉淀环直径(m m)为纵坐标;
以标准浓度的对数值(Lg)为横坐标绘制标准曲线.
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标准曲线与样品测定结果(实物实拍)
测定样本: 病人血清( 标本 1. 25mm, 标本 2. 20mm )
标准曲线制备:标准抗原稀释4钟浓度,预温24h,沉淀环直径数据
① 30 m m ② 25 m m ③ 20 m m ④ 15 m m
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以沉淀环直径为纵坐标,以抗原标准浓度的对数值(Lg)
为横坐标绘制标准曲线,根据样本测得直径,查出结果。
沉淀环直径(毫米)
4
2
5
6
7
3
8
标准抗原稀释: 1 :10, 1 :20 , 1 :40, 1 :80 , 1 :160
相当抗原浓度: 100mg 50mg 25mg
沉淀环直径: 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm
Lg值:
9
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【实验方法】
1. %免疫盐水琼脂液
,加入100ml. NS,混匀加热溶解。
加热时用玻棒不断轻轻搅拌,使成透明液体,放56℃,
加入 1 : 2 稀释的羊(兔),混匀,
56℃保温备用。