文档介绍：
了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
二、原理
以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。
在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值)Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。
本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器
1、 新华滤纸
2、 层析缸
3、 细线
4、 点样管
5、 橡皮筋
6、 电吹风
7、 喷雾器
四、实验试剂
1、 混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸)
2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v)
3、%茚三***—无水***溶液:***溶于100ml无水***,贮于棕色瓶中
五、实验步骤
1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画一圆点(原点)。
2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。
3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。
4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。
5、均匀喷上茚三***—无水***液,注意使溶液不倒流,不间断。
6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。
7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看)
从左到右依次为H、H1、H2、H3、H4。
H1= H2= H3= H4= H=
由此可得
Rf1=
Rf2=
Rf3=
Rf4=
据此可知,混合氨基酸是由甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phy)组成。
实验中出现了拖尾的现象。
拖尾现象是指展层,显色后在层析分配图上,所看到的某一种氨基酸的分子位移,不是如标准图谱所示的那样,完整地显示在某一位置上,而是形成象笤帚似的那样,前端粗圆而逐渐细小下来,宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。
图象的出现,是在实验中对影响Rf值的主要因素要求,掌握不够所致。诸如,物质结构与极性对Rf值的影响,层析溶剂对Rf值的影响,PH对