文档介绍：优
秀
毕
业
设
计
论
文
二0 年月
河北医科大学
硕士学位论文
阿仑磷酸盐诱导破骨细胞凋亡的实验研究
姓名:高明津
申请学位级别:硕士
专业:口腔临床医学
指导教师:唐全勇;赵华平
阿仑磷酸盐诱导破骨细胞凋亡的实验研究椒ǎ菏笛榉至阶椋禾逋馐笛樽细胞培养组禾迥去净骨表面的软组织,剪断长骨两骺端,暴露骨髓腔,用去掉体积的旧培养液,换以同体积的含目的:在成功的建立体外大鼠破骨细胞培养系的基础一次性注射器吸取迦胨枨怀逑矗离心。这样洗涤细胞两次后,加入胞悬液,注入孔培养板/孔和培养瓶/瓶,同时加入使其终浓度为一痩,然后℃孵育箱中培养。每旄灰淮闻嘌海新培养液。培养至第六天时,经倒置相差显微镜和特异染色证实所培养的细胞为破骨细胞。培养板组和对照组:培养至第欤尤階,使其要上观察不同浓度的阿仑磷酸盐在体外实验中诱导破骨细胞凋亡的情况,并通过体内实验加以论证。实验组锸笛樽。体外实验。全骨髓细胞的提取及培养:将芰湫坌大鼠乙醚麻醉,断颈处死。无菌条件下取股骨和胫骨,骨发白。收集细胞悬液,然后以转/分钟离心种樱弃去上清液,再加入荡蚓群蠼卸甅全培养液寤质バ律QG澹嗝顾痬疵素痬,计算细胞数,配成痬南放入终浓度为一,~,一,巧哉兆楦柰寤摘中文摘要
磷酸缓冲液绦嘌∈薄H缓螅桨謇胄蝝小时后,细胞刷轻刮瓶壁,洗涤两次,送流式细胞仪检测。用甐和结合检测凋亡的破骨细胞数目。体内实验。给药:将淮笫笏婊殖捎靡┳骨鸵跣远哉兆,按痥亮扛骨荒谧⑸比妥钠腹腔内注射,每只鼠注射.,待大鼠全身瘫软,进入麻醉状态,将其四肢固定,剪开胸入主动脉,同时剪开左心耳,进行心脏灌流。先以液将全身的血液冲出,然后注入固定液.%戊二醛,多聚甲醛,液笫笕斫┲焙螅V构嗔鳌按体外实验的方法取其股骨和胫骨,然后放入固定液中,入褐冰箱过夜。第二日,#种樱琓旧ǎ迪录剖靠椎钠乒细胞数目。再滴加疽海ǘ任室温下避光放置分钟,撼逡撼逑锤删唬⒂寐纸吸干液体,倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态和数培养瓶组和对照组:同上,培养至第焓保尤胪板中浓度一致的屯寤腜缓冲液,培养蚉连续铡灌流固定及取骨:最后一次给药小时后,ノ彀种雍螅部皮肤及皮下组织,暴露心脏,用号针从左心室直插浸润固定小时。脱钙:将固定好的骨标本用撼逑锤删唬型迅周,隔日换液一次。的中文摘要目。
制作骨切片:将脱好钙的骨标本常规梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,℃孵育箱孵育,分钟后取出,用蒸馏水冲钟,,二次脱水,二甲苯透明,树胶封六天染色,胞浆呈紫红色且伸出许多细长的伪足样突起,细胞核多者为破骨细胞。加药后,对照组的阳性细胞数目明显多于用药组,且胞浆丰满,内含许多空泡结构,缩,核仁结构不清晰,但与正常的破骨细胞的体积大小近似。这种形态学特征就是凋亡。相比较而言,二者在形态计数各组的破骨细胞数,对照组的细胞数为除培湮尴灾圆钜焱猓邢灾圆钜欤表明破骨细胞数目随呐ǘ仍黾佣跎伲秸哂屑片备用。染色:石蜡切片常规脱蜡至水。在常温下,将配好的染色液滴于切片上,每张巫笥遥缓蠓入洗干净。苏木素复染:将染好的切片放入苏木素中结果:⑻逋馐笛榻峁旧ń峁号嘌核仁清晰,核呈圆形或椭圆形,体积较大。而用药组不仅细胞数目少,且细胞多胞浆皱缩,染色极深,核固上还是很好区分出来的。同时,用药组与对照组均未见到死亡的破骨细胞。飨远嘤诟饔靡┳.,.,.±.。且各用药组间量依赖性。片。中文摘要
中没有死亡的破骨细胞。太ü馊旧ń峁篐种活细胞染料,将显微镜调至段,在染色的背景映衬下可见,一些加入双磷酸盐的细胞发出明亮的蓝色荧光,而对照组的细胞多呈现微弱的荧光,说明用药组分加入甐检测早期凋亡,另一部分则加入嘀毓鄄焱砥诘蛲觥@昧魇较赴现,而且随着药物浓度的提高,凋亡的比率也增加。有少观察到的情况是一致的。同时,当破骨细胞凋亡时,可发生降解,使胞内的烤突峒跎伲庋谡的二倍体峰前会出现一个亚二倍体凋亡峰./。检测图中用药组可看到此峰,而在对照组此峰几乎不存在。⑻迥谑笛榻峁从形态上,用药组可见到许多细胞呈现胞核固缩,胞浆浓染,有的细胞还出现核碎裂,而对照组表现为核大,圆形或椭圆形,核仁清晰,胞浆丰满。计数用药组与对照组的破骨细胞数目,用药组的细胞凋亡数目为.±明显高于对照组的繭.,:阿仑磷酸盐具有抑制破骨细胞形成和分化的作用,其作用机理是使破骨细胞及破骨前驱细胞且的细胞多发生了凋亡。流式细胞结果:培养瓶中的细胞分成二部分。,而对照组则未出量的细胞出现晚期凋亡,却没有死亡的细胞,这与培养板中文摘要
陆慧耗巾媵毯氚锏蛟体内实验,体外实验。