文档介绍：实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量
一、目的
1、学****一种蛋白质染色测定的方法
2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法
二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有***橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成蓝色的蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比,因此可用于蛋白质含量测定。
反应2—5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时。— mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、***、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具
(一)试剂
1、染色液:取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加100ml 85%磷酸,加水稀释至1升。棕色瓶保存,该染色液可保存数月,若不加水可长期保存,用前稀释。
2、标准蛋白溶液:。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制,浓度控制在10—30mg/ml
(二)器具
1、试管及试管架
2、移液管(1ml,5ml)
3、可见光分光光度计
四、操作步骤
(一)标准曲线的制作
1、取7支试管,按下表加入试剂
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
蛋白标准溶液
0
1
蒸馏水
1
0
考马斯亮蓝
5
5
5
5
5
5
5
2、将试管摇匀,放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
4、以A595nm为纵坐标,标准蛋白色质浓度为横坐标,绘制标准曲线。
(二)样品的测定
1、取一支试管,,.
2、将试管摇匀,放置20分钟。
3、比色测定吸光值A595nm,对照标准曲线求得蛋白质的浓度。
五、注意事项
1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠,试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低,因而当蛋白质浓度较大时,标准曲线稍有弯曲,但直线弯曲程度很轻,不致影响测定
2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始,力争1hr内完成,否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。
六、实验报告
绘制标准曲线,并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。
七、思考题
1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么?
2、考马斯亮蓝法有什么优缺点
Bradford 法的优点是
(1)灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复