文档介绍：His Tag蛋白纯化方法之选择全攻略(1)[选购宝典]
生物通技术专题之HisTag蛋白纯化篇:用基因工程的方法来表达蛋白质,必须经过纯化才能实现最终目的。相比核酸纯化来说,不同的蛋白质特性千差万别,纯化条件很难摸索,想找一种通用的纯化方法一直是个难题。将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达,通过亲和纯化Tag蛋白来纯化目的蛋白,是我们常用的间接手段。
用于融合表达的亲和纯化蛋白标签,首先个子越小越好,这样不会对目标蛋白的构象、大小和特性产生显著影响,方便直接对融合蛋白进行下游操作;以前常用的融合表达亲和标签GST(谷胱甘肽转移酶)个子就比较大,在纯化后需要先切除标签后才能进行下一步的检测分析。其二生理条件下带电越少越好:需要借助融合表达纯化的许多蛋白通常在生理溶液pH下进行分析研究或者复性,融合标签带电少,对蛋白质的表达、分泌、折叠、构象形成等影响小,比较容易得到和天然蛋白相似的产物。第三融合标签的免疫原性越少越好,融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫
横看竖看,6xHis Tag都是比较理想的,6个组氨酸个子小,pH8是不带电,免疫原性差,利用优质的带镍离子的纯化填料进行亲和纯化,目标蛋白纯度高,方法简单方便,成本低,已得到国内外研究人员的广泛应用。想当年刚进实验室时,表达6xHis的HisTag还算“前卫”技术(表达纯化一个带有HisTag的“有重要意义和光辉前景的”蛋白就可以混个硕士毕业),如今早成主流了。
我们生物通技术专题早前的表达系统专题中已经介绍过多种带有His-Tag的表达载体,表达之后自然需要考虑如何纯化,市面上纯化HisTag的产品多种多样,应该如何选择呢?。金属镍离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上,当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时,融合蛋白被特异亲和吸附,杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白。最常用的螯合物包括氮川乙酸(NTA)和亚氨二乙酸(IDA),它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位点。生物通在这里介绍几个市面口碑较好的产品和方法,包括常见的HisTag纯化高端品牌:Qiagen,GE,Novagen等。
Qiagen产品的2大特点是4价螯合的Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid);以及种类齐全。Qiagen专利的4价螯合的Ni-NTA纯化填料,由于镍离子通过4价键螯合在纯化树脂(填料)上,比3价的Ni-IDA要稳固且不容易脱落,且NTA与还原二硫键的beta- 巯基乙醇相容;而存在其它螯合或还原成分时, IDA树脂的金属镍离子容易脱落可导致纯化结果不甚理想。因此Ni-NTA实际应用中的蛋白纯化效率和得率较高。因于这种稳固性,Qiagen的Ni-NTA纯化介质不单可用于纯化带HisTag的表达产物,还可以作为固定介质用于研究蛋白质间的相互作用或者蛋白质和核酸间的相互作用、研究蛋白质受体和配基的相互作用、甚至用于纯化与融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。
Qiagen的Ni-NTA纯化介质产品种类最为齐全,设计非常细心体贴,不过花太多,就容易眼花缭乱,我们说花多眼乱。Qiagen的目录里是根据纯化实验的规模分为大、中、小规模,具体又分为高通量和手工纯化等区别,对于急着寻找自己