文档介绍：蛋白酶的盐析沉淀实验报告
班级:生工1005 学号:0203100520 姓名:朱同辉
实验目的:
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实验原理:
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐,蛋白质溶解度增加,称为盐溶;而加入大量中性盐达一定浓度,蛋白质就会沉淀,称为盐析。
原理: ①大量盐加入后,能与蛋白质争夺水分子,去除水膜;
②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷,使分子间静电斥力减弱,疏水作用增强,使蛋白质沉淀。
盐析效果: 二价离子> 一价离子
离子半径小> 离子半径大
阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+
阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn经验式来表示:
式中:S—蛋白质的溶解度
I—离子强度
β—常数,与温度和pH有关
Ks—盐析常数,与蛋白质和盐的种类有关
其中I 根据下式计算:
式中:ci—i 离子的浓度(mol/L)
zi—i 离子所带的电荷
蛋白酶活力的测定
福林(Folin)试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物,蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸,将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用,根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量,从而推断酶活力的大小。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
K—(μg),
N—酶液稀释倍数
4—酶反应液为4 ml,取出1 ml测定,故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数:原酶、饱和度20%,30%,40%,50%,60%,70%的上清液分别为1000,200,150,100,100,100,50倍
实验步骤:
1)蛋白质盐析
分两个大组进行实验,每大组取6只烧杯编号,分别加入50 ml蛋白酶液,,,,,(对应20%,30%,40%,50%,60%,70%饱和度),在磁力搅拌器不断搅拌下,将其缓慢加入酶液中,加完后再搅拌5 min,使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中,在天平上称重平衡,用高速冷冻离心机离心于10℃,10,000 r/min离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积,并分别测定酶活(u/ml),即为该酶的溶解度S。
2)蛋白酶活力的测定:
%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2,分别吸取待测酶液1ml放入试管中,40℃水浴中预热1-2min
***醋酸2ml,再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml,计时摇匀,40℃反应10min
、***醋酸2ml,摇匀,取出3支试管静置10min
5. 另取3支试管,分别吸取上述清液1ml,,福林试剂1ml,于40℃水浴中保温20min显色。
,在波长680nm处