文档介绍：生物化学实验报告
姓名:
学号:
专业年级:
组别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
(Title of Experimetn)
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
实验日期
(Date of Experiment)
2013-12-11
实验地点(Lab No.)
合作者(Partner)
指导老师(Instructor)
总分
(Total Score)
教师签名(Signature)
批改日期
(Date)
【实验报告第一部分(预****报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】
实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
5、了解柱层析技术
实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。
盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,。,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱
DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液
醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸
1%BaCl2溶液氨基黑染色液
漂洗液
电泳仪、电泳槽
实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定)
实验步骤:
盐析+凝胶柱层析除盐:
,,混匀室温放置10min,4000r/min离心10min
上清液(含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)
沉淀(含球蛋白)加水
过葡聚糖凝胶G-25层析柱(×7cm)
过葡聚糖凝胶G-25层析柱(×7cm)
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, NH4AC缓冲液洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质
用1ml NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续