文档介绍：生物秀实验频道——生命科学实验中心 101
SSDSDS--聚丙烯酰聚丙烯酰胺胺凝胶电泳凝胶电泳((PPAAGEGE))
测测定定蛋白质分子量蛋白质分子量
授课教师:周杰
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一一.. 实验实验目的目的
••学习学习SSDSDS--PPAGEAGE测定蛋测定蛋白白质质分子分子量量的原的原
理。理。
••掌掌握垂握垂直直板电泳板电泳的的操作操作方方法。法。
••运用运用SSDSDS--PPAGEAGE测定蛋测定蛋白白质质分子分子量量及染及染
色色鉴定。鉴定。
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二二..实验实验原理原理
••带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这
种现象称为电泳。
••电泳分类:移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
••区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄
层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支
持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机
械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而
产生的对流。
••区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃
珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树
脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,
现在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶。
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二二.. 实验实验原理原理
•• PAPAGEGE根据其根据其有有无无浓浓缩缩效应效应,,分为分为连连续续系统系统
和和不不连连续系续系统统两大两大类,类,连连续续系统系统电泳电泳体系体系
中中缓冲缓冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度相度相同同,,带电带电颗粒颗粒
在电场作用在电场作用下下,,主要主要靠靠电电荷荷和和分子分子筛效筛效
应应。。不不连续连续系统系统中由于中由于缓冲缓冲液液离离子子成成分,分,
pHpH,,凝凝胶胶浓浓度度及电及电位梯位梯度的度的不不连连续性续性,带,带
电电颗粒颗粒在电在电场场中中泳动泳动不仅不仅有有电荷电荷效应效应,分,分
子子筛筛效应效应,,还具还具有有浓缩浓缩效应效应,,因因而其而其分分离离
条条带带清晰清晰度及分度及分辨辨率均率均较较前者佳前者佳。。
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二二.. 实验实验原理原理
•• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中
引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分
子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使
半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强
还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负
电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的
SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分
子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白
质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是
按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移
速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间
时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下
式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,
k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对
分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相
同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线
上求得分子量。
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二二.. 实验实验原理原理
•• SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中,待别
是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影
响它们结合的因素主要有三个:
1)1) 溶液中SDS单体的浓度,当单体浓度大于
1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比
为1:, mmol/L以下
时,两者的结合比仅为1: 0.