文档介绍：DNA琼脂糖凝胶电泳
实验二
学时:3
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1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
2、学习核酸染色的方法。
一、实验目的:
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(一)电泳技术:
1、电泳定义:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
根据电泳支持介质的不同,可分为滤纸,醋酸纤维薄膜,淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术的应用非常广泛,从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。
二、实验原理:
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(1)带电颗粒的大小和形状:颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快;
(2)颗粒的电荷数:电荷越少,电泳速度越慢,反之越快;
(3) 溶液的粘度:粘度越大,电泳速度越慢,反之越快;
(4)溶液的pH值:影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度越慢,反之越快;
2、影响电泳的主要因素:
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(5)电场强度:电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快;
(6)离子强度:离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快;
(7)电渗现象:电场中,液体相对于固体支持物的相对移动;
(8)支持物筛孔大小:孔径小,电泳速度慢,反之则快。
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琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法,是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法,已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。
琼脂糖英文名agarose,是从琼脂中提取出来的,-脱水- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶,电泳中具有分子筛效应。
(二)琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理:
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DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动(电荷效应) 。
DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外,还与DNA分子的大小和空间构象有关(琼脂糖凝胶的分子筛效应)。
电泳时,用溴酚蓝做前沿指示剂,指示DNA样品在凝胶中的确切位置。
溴乙啶是一种荧光染料,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间,与DNA分子形成络合物,在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。这次实验使用溴乙啶替代品(DNAgreen)
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DNAgreen核酸染料
DNAgreen是一种花箐类染料,具有安全、灵敏作为各种核酸电泳的染色剂。
DNAgreen最大吸收峰在510nm左右,另外在254-380nm还有一个吸收峰,与核酸结合后发射绿色荧光,因此在紫外凝胶透射仪上可以检测出DNA样品。
作为EB的一种替代品。
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(1)核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系凝胶中,DNA片段迁移率与DNA分子大小成反比(≤ 20kb) ,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。
(2)核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系    不同构型DNA的移动速度次序为:闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA(当琼脂糖浓度太高时,环状DNA不能进入胶中)。
(3)不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度/%                               线状DNA大小/kb   60-5  20-1  10-  7-   6-  3-   2-注:DNA片段在5-500bp之间时,一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行电泳分离。
(三)琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
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(1)操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。(2)凝