文档介绍：实验目的
•了解荧光显微镜使用原理
•了解荧光显微镜标本制作要求
•了解使用荧光显微镜的注意事项
•荧光图像的记录方法
掌握荧光显微镜对细菌及微藻的观察,提交实验报告(包括拍摄图片)
实验原理
某些物质经一定波长的光(如紫外光)照射后,物质中的分子被激活,吸收能量后跃迁至激发态;当其从激发态返回到基态时,所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外,其余较大部分则以光能形式辐射出来,由于能量没能全以光的形式辐射出来,故所辐射出的光的波长比激发光的要长,这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光(如紫外光)的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。由此可见,被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件:①物质分子(或所特异性结合的荧光染料)必须具有可吸收能量的生色团;②该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境(如溶剂、pH、温度等)。
荧光显微术是利用荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态,从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光),这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光, 称为自发荧光(或直接荧光),如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光,但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光,这种荧光称为次生荧光(或间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出桔红色荧光。
荧光显微镜具特殊光源(多为紫外光光源),提供足够强度和波长的激发光,诱发荧光物质发出荧光。在视场中所所观察到的图像,主要是样品的荧光映像。
(一)载玻片
~,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
(二)盖玻片
,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如***化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光女可激发标本。
(三)标本
组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。
(四)封裱剂
封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,~,不易很快褪去。所以, ~。
(五)镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用上述甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。
使用荧光显微镜的注意事项
(1)严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。
(2)应在暗室中进行检查。进入暗室后,接上电源,点燃超高压***灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。
(3)防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1~2h为宜,