文档介绍：河北北方学院
毕业论文开题报告
题目:羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究
姓名: 刘长松
院系: 动物科技学院
专业: 动植物检疫学
年级: 07级动植物检疫学本科班
学号: 20071040111
指导教师: 张富梅
开题时间: 2010-12-17
河北北方学院教务处制
论文题目
羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究
课题来源
河北省科技厅课题
研究方向
预防兽医学
一、立题依据(研究的目的与意义)
羊附红细胞体病是由羊附红细胞体(E. ovis)寄生于羊的红细胞表面及血浆中所引起的一种烈性传染病,以发热、黄疸、溶血性贫血为主要症状,也可能和其它疾病混合感染,表现不同交叉症状。急性感染的羊临床症状典型,严重病例出现溶血性贫血,造成死亡,给养羊业造成巨大的经济损失。
目前,诊断该病常用的镜检法准确性较差,血清学诊断因提取抗原的纯度较低,其特异性和灵敏性受到了影响,因此确诊该病有一定困难,在临床上往往因此而延误治疗时机,因此已经引起动物医学界的高度重视。
探索快速准确的诊断方法是控制该病的有效途径,而获得高纯度抗原是关键。1986年, Lang首次从绵羊红细胞上分离出附红细胞体,1988年,Hall对Lang的方法进行了改进,建立了分离附红细胞体的方法,推进了附红细胞体病血清学诊断和分子生物学研究的进程。目前该方法仍被广泛应用,但存在收率低、纯度差等不足之处。在制备过程中,采血、洗涤红细胞以及摇床振摇等操作都可能造成红细胞溶血,导致所制备的抗原纯度降低,这必然影响血清学检测的准确性和特异性。针对这一问题,许多学者正在努力探索附红细胞体解离的方法,以求获得高纯度抗原。
贾立军等于2004年比较了水浴法和化学试剂法解离猪附红细胞体效果,结果显示水浴法优于化学试剂法, 于2005年将两种方法用于解离牛附红细胞体,结果化学试剂法比水浴法好。也有应用低渗法、皂素法和冻融法裂解红细胞,然后收集附红细胞体的方法,但这些方法获取的抗原纯度均不是很高,收率低,并且工作量和难度都比较大。
本研究在前人研究的基础上,拟应用药物体外驱虫法,从被感染羊血样中分离附红细胞体抗原,再应用切胶纯化技术、SDS-PAGE和免疫印迹技术分析粗制羊附红细胞体的抗原成分,探究并提取有良好抗原性的蛋白成分,并制备特异性抗原,为建立特异、灵敏的血清学诊断方法奠定基础。
二、研究内容:
采集红细胞感染率>90%的羊附红细胞体阳性抗凝血,应用药物体外驱虫法(每200mL血液依次加入双向红莲灭1mL)对羊附红细胞体进行解离,制备羊附红细胞体悬液。经过超声波裂解,制备附红细胞体抗原全蛋白悬液。应用羊附红细胞体抗原蛋白裂解液免疫家兔,制备兔抗羊附红细胞体阳性血清。将所制的的抗原蛋白进行SDS-PAGE试验,观察羊附红细胞体全抗原蛋白组分,选择4条染色较深的抗原蛋白进行切胶纯化,应用SDS-PAGE检验纯化结果,再应用免疫印迹技术确定有免疫原性的抗原蛋白成分。利用切胶纯化技术收集有免疫原性的抗原蛋白成分。
(1)采集血样采集羊血样,发现羊附红细胞体红细胞感染率>90%者,颈静脉无菌采血,备用。
(2)应用体外驱虫法解离羊附红细胞体每200mL血液加入双向红莲灭1mL。
(3)制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液应用超声波裂解法制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液
(4) 测定蛋白质浓度
三、研究方法与技术路线
2 羊附红细胞体特异性抗原制备
(1) 兔抗羊附红细胞体阳性血清的制备
(2) 兔阴性血清的制备
(3) 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验
(4) 主要抗原蛋白的切胶纯化
(5) 纯化抗原蛋白的SDS-PAGE试验
(6) 纯化抗原蛋白的免疫印迹试验及特异性抗原蛋白的筛选
(7) 应用切胶技术回收特异性抗原蛋白
查阅文献、试验动物的选取
应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原
羊附红细胞体特异性抗原制备
(1)采集血样
(2)羊附红细胞体解离
(3)制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液
(4) 测定蛋白质浓度
(1) 应用羊附红细胞体抗原蛋白悬液制备兔抗羊附红细胞体阳性血清的制备
(2) 兔阴性血清的制备
(3) 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验
(4)主要抗原蛋白的切胶纯化
(5) 纯化抗原蛋白的SDS-PAGE试验
(6) 纯化抗原蛋白的免疫印迹试验及特异性抗原蛋白的筛选
(7) 羊附红细胞体特异性抗原的制备
数据分析整理、结果分析并完成研究报告和论文