文档介绍：还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。
 
三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 实验材料
小麦面粉;精密pH 试纸。
2. 主要仪器
(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11
(2)大离心管:50mL×2
(3)烧杯:100mL×1
(4)三角瓶:100mL×1
(5)容量瓶:100mL×3
(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1
(7)恒温水浴锅
(8)沸水浴
(9)离心机
(10)扭力天平
(11)分光光度计
3. 试剂
(1)1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
和262mL 2M NaOH 溶液,加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中。
(4)酚酞指示剂:,溶于250mL70%乙醇中。
(5)6M HCl 和6M NaOH各100mL。
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL 具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
                             表1 葡萄糖标准曲线制作
2. 样品中还原糖和总糖的测定
(1)还原糖的提取
食用面粉,放入100mL 烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL 蒸馏水,搅匀,置于50℃恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL 离心管中,于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL 蒸馏水洗一次,再离心,将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。
(2)总糖的水解和提取
,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl,置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后,加入1 滴酚酞指示剂,用6mol/LNaOH 中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中,混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容,混匀,作为总糖待测液。
(3)显色和比色
取4支20mL 具塞刻度试管,编号,按表2 所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
五、结果与计算:
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
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