文档介绍：2012年生物化学实验B
实验报告
姓名: XXXX
学号: XXXXXX
实验时间: 2012年11月17日
实验分组: 第7组
组内成员: XXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXX
任课教师: XXXX
摘要
本实验通过从小牛肠中通过刮去,离心,析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶,再通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量,利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。
实验部分
:
(1)正丁醇、丙酮。
(2)1 mol/L 醋酸,1 mol/L NaOH,硫酸铵。
(3)平衡缓冲液: mol/L Tris-HCl,pH 。
(4)底物缓冲液:1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。
(5)酶的底物溶液:用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。
(6)30% 丙烯酰胺置棕色瓶。
(7)分离胶缓冲液: mol/L Tris-HCl缓冲液,pH ,已加入10% SDS。
(8)浓缩胶缓冲液: mol/L Tris-HCl缓冲液,pH ,已加入10% SDS。
(9)10% 过硫酸铵。
(10)TEMED(四甲基乙二胺)。
(11)上样缓冲液:称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油, mL巯基乙醇、2 mL pH Tris-HCl,加超纯水定容至10 mL。
(12)染色液:% 考马斯亮蓝R250,40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500 mL,过滤后备用。
(13)脱色液:500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL。
(14)电泳缓冲液。
匀浆机、eppebdorf5型冷冻离心机、GSY—2型恒温水浴、UV762型紫外可见分光光度计。离心管,剪刀,载玻片,不锈钢盘,搪瓷盘,滤布,漏斗,分液漏斗,量筒,烧杯,移液抢,比色皿,DYY—11型电泳仪,24D型电泳槽,制胶板,揺床,移液枪。
小牛肠碱性磷酸酶提取方法
1)取新鲜小牛肠,用剪刀剖开,用载玻片刮取小肠内粘膜,放到盘子一角。
2)将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中,加冰冷蒸馏水,高速匀浆,重复多次。
3)缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在4℃,10000 rpm条件下离心。
4)用滤布过滤去除杂质,倒入分液漏斗中,静止分层,取下层水相,。4℃,10000 rpm,离心。
5)得到上清后放入离心管中,,称取硫酸铵加到离心管中溶解;再加冰冷丙酮,混匀,4℃静置30 min以上。4℃,10000 rpm,离心。
6)上清液中加入冰冷丙酮,4℃放置30 min以上。4℃,10000 rpm,离心。
7)取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。
8)底物处理:底物37℃水浴5 min。
小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法
1)将酶稀释10倍。
2)紫外分光光度计检测条件为405 nm波长,测定时间60 s,取值2 s,-。3)取2个2 mL比色皿,加入上述(2)加热的底物缓冲液,校对归零。
4)将稀释10倍的酶液加到其中1个比色皿中(仪器外侧),用