文档介绍：一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干,准备足够枪头。
2、准备催化剂,在光下呈透明状为分散性较好,否则用超声清洗器(位于化学间)超声分散5min,期间准备底物(如TMB或者ABTS),浓度依照自己实验的要求定(10mg/mL或5mg/mL),一般1mL足够用,。TMB(外间冰箱上层)溶于DMSO(二甲亚砜,位于化学间王春雨的柜子里),ABTS(与TMB放在一起)溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪(位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中)、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中,放到对面酶标仪前,开空调定室温(25℃,提醒其他人随手关门),24孔板中其中一排加入适量H2O2(每孔1mL左右,注意避光,可在板上盖一张卷纸),将缓冲液、催化剂、底物放实验台上,-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序:
催化底物TMB(或ABTS)的酶促动力学过程加样顺序:①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB(ABTS)(0,,1,2,4,6,8,10µL) ④32µLH2O2(排枪加)
催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序:①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2(2,4,6,8,10,16,32,64µL) ④10µL底物TMB(ABTS)(排枪加)
数据记录按下表记,Code为每次读板时的微孔板编号,Time为对应的读板时的时间,一般30s读板一次,可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
TMB
0
1
2
4
6
8
10
V01
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
H2O2
2
4
6
8
10
16
32
64
V01
二、实验
1、打开酶标仪(开关在仪器后部,若仪器没反应,请检查电源是否接通),密码为5个0,按Enter键进入系统。电脑开机,密码为mby-nano,双击酶标仪软件图标,出现登录框,直接点击“登录”,进入酶标仪控制界面
,若底物为TMB,选择“铁动力学”(波长为650nm)
,选择模板1
;
打开电脑内置时钟,
若底物为ABTS,则检验项目选择“gg”(波长为405nm) 。
新建一个word文档,以日期命名,打开。
2、加样:96孔板从左至右编号为1-12,自上而下编号为A-H。以TMB为例,从第1列加样:
①从A1至H1,每孔加200µL NaAc/HAc Buf;
②从A1至H1,每孔加10µL催化剂(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系);
③从A1至H1,每孔分别加不同体积(0,,1,2,4,6,8,10µL)TMB(每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系);
④用排枪吸取32µL H2O2加入A1至H1,快速放入酶标仪中,点击“读板”,记下读板时间(如下表所示,假设第一次读板时间为09:00:00)
Code
1
2
3
4
5
6
7
Time
00:00
00:30
01:00
01:30
02:00
02:30
03:00
03:30
TMB
0
1
2
4
6
8
10
V01
用排枪加H2O2时,注意检查枪头是否插紧,否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪,再加H2O2,这样可以节约时间。每次读板出来结果后,点击“结果入库”——>“是”——>“确定”,按下“PrintScreen”键,点击“退出”,打开word文档,ctrl+V或者右击选“粘贴”,保存结果,要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存,可点击“查询结果”,下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据,按ctrl键点击该处文字见方法)
3、第一组数据保存后,将第一组的反应液倒掉,用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据,拷贝到U盘里,整理实验台,关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验,将24孔板中剩余的H2O2倒掉,用清洁剂洗后,再用二次水冲洗一次,放入烘箱中烘干。移液枪放回原处,催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、,点击右上角的“Add New Column”(箭头所指):
,亦可右击——> Add New Column
。
2、输入数据:命名各列,X列命名为时间,单位s,8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s,0 s对应微孔板编号1的数据,30 s对应code2的数据,以此类推,将所读数据输入。