文档介绍：实验六定磷法测定核酸浓度
。
,并由此计算核酸的量。
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钼蓝法比色定磷的原理
1)钼蓝显色剂+ 无机磷钼蓝复合物
2)在一定范围内,蓝色的深浅和磷的量成正比,可用比色法测定
实验原理
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实验内容
标准磷溶液定磷曲线的制作;
RNA消化;
测定RNA消化液总磷含量;
计算RNA溶液中RNA的浓度。
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1、标准曲线(定磷曲线)的用途
管号
步骤
1
2
3
4
5
6
7
8
标准磷溶液/mL
0
H2O/mL
3
定磷试剂/mL
3
3
3
3
3
3
3
3
反应条件: 45℃,25min 660nm测定吸收值
磷含量(μg)
A660nm
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RNA消化的目的?
为什么将原液消化算回收率?
总磷
无机磷
RNA磷
测定值
DNA磷
消化回收率
根据标准磷原液计算回收率
直接用钼蓝法进行测定
由总磷量和无机磷量计算可得
核酸
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试剂与器材
1. 钼蓝显色剂
2. 标准磷试剂、标准磷原液
3. 分光光度计
4. 烧杯、搅拌棒、滴管、容量瓶
5. 凯氏烧瓶
6. 试管
7. 水浴锅
* 本实验配置试剂所用的水指的是蒸馏水
三、试剂和器材
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四、操作步骤
1)标准曲线样品的准备(4组同学,测三条标准曲线)
2)无机磷的测定(另外一组同学做总磷测定和无机磷测定)
试剂
0
1
2
RNA样品/ml
-
蒸馏水
0
0
定磷试剂
A660nm
3)反应条件: 45℃,25min
管号
步骤
1
2
3
4
5
6
7
8
标准磷溶液/mL
0
H2O/mL
3
定磷试剂/mL
3
3
3
3
3
3
3
3
滤纸过滤
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3)总磷样品的准备(八人一组)
管号
步骤
0
1
2
3
4
RNA/mL
-
2
2
-
-
标准磷原液/mL
-
-
-
2
2
H2O/mL
1
-
-
-
-
10mol/L H2SO4/mL
4
4
4
4
4
168-200℃消化30min,溶液呈黄褐色,冷却
30%H2O2(滴)
2
2
2
2
2
168-200℃继续消化至溶液透明,冷却
H2O/mL
1
1
1
1
1
沸水浴中加热10min(分解焦磷酸),冷却
用水定容/mL
100
100
100
100
100
显色方法P19
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3. 注意事项
1)清洗实验用容器不要用含磷清洗剂
2)消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
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五、结果及数据处理
1) 标准曲线
2) 总磷量计算
回收率的计算
样品总磷浓度( ug/ml)计算:P真实=P测定/回收率
3) 有机磷=总磷-无机磷
4) 核酸含量计算
计算得知有机磷的浓度(ug/mL),,便可求得该RNA样品中磷的含量(ug),因核酸中含磷酸量为9%左右,1ug磷相当于11ug核酸,进一