文档介绍：酵母操作手册
(一)酵母的冻存、复苏以及培养
注:本手册改编自商业化酵母操作方案,依据本实验条件修改,并不适合所有实验室!
培养基配方:
10X Dropout 粉剂(1L)
AA Name
所购数量( g )
10X 浓度(mg/L)
实称(g)
L-Isoleucine
5
300

L-Valine
25
1500

L-Arginine HCl
50
200

L-Lysine HCl
50
300

L-methionine
10
200

L-Phenylalanine
10
500

L-Threonine
10
2000
2
L-Tyrosine
25
300

L-Uracil
25
200

共计

将各AAs称量后,在研钵中磨合混匀,置于干净器皿中。
单独用AA筛选溶液
AA名称
体积( ml )
浓度(mg/ml)
实称(g)
L-Adenine hemisulfate salt
100
2

100 X
L-Histidine HCl monohydrate
100
2

100 X
L-Leucine
100
10
1
100 X
L-Tryptophan
100
2

100 X
过滤除菌
YPDA(1L)
浓度
实称(g)
Difco peptone
20 g/L
20
Yeast extract
10 g/L
10
Agar (for plates only)
20 g/L
20
Glucose
2%
20
Adenine hemisulfate
%
15 ml %Ade
SD Media (1L)
浓度
实称(g/ml)
加H2O至1000ml, 114℃,20min。
YNB
g
Agar(for plates only)
20 g
Glucose
2%
20
10X基本DO 粉剂
g
100X单独用AA
10 ml
1. 长期冻存:
无营养缺陷型的酵母株存在含25%甘油的YPDA中,然后冻存于-70℃冰箱中,若要保存大于一年,务必使温度不要低于-55℃。
转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25%甘油的相应的缺陷型培养基(SD)中,以避免质粒丢失。
制备方法:
用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出,置于含200-,注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中,然后盖好盖,在旋涡器上剧烈振荡混匀,再加入无菌甘油,使其终浓度为25%,再次振荡混匀,存于-70℃冰箱中。
2. 复苏:
,加入100-200μl YPDA或SD,用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中,稍微涮洗一下牙签(让挑取的冰屑融化),混匀后吸取100μl涂平板,30℃培养2-3天。
刚长出克隆的平板用封口膜密封后,在4℃可保存1-2个月。
注意:有时冻存的酵母可能沉到离心管底部,所以在复苏时,将其全部融化,然后振荡混匀,再复苏。
:
用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆,每5ml液体培养基所需的克隆大小为2-3mm,所以,如果单个克隆不够,可以多挑几个。剧烈振荡,使酵母细胞分散到液体中,30℃,200rpm振荡培养16-18hr,但通常好像需要24hr,甚至更长才能达到稳定期(OD
600 > ),所以一般在上午开始摇,第二天下午收。
如果需要中期培养物,则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = -,然后30℃,200rpm振荡培养3-5hr,此时的培养物OD600 = -。可见酵母的细胞周期约为3-5hr。
(二)质粒转化酵母细胞手册
试剂配方:
单链Carrier DNA (SS-DNA)(2 mg/ml)
注意:你不需要将Carrier DNA超声切割,因为实验证明Carrier DNA越大效果越好!只要如下操作即可。
1. 称取200mg高分子量DNA(III型脱氧核糖核酸钠盐,鲑鱼精DNA,Sigma D1626),溶于100ml TE(10mM , PH , EDTA)。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化,然后用磁性转子于4℃缓慢搅拌过夜使其完全溶解;如果紧急,也可于室温剧烈搅拌2 – 3hr使其完全溶解。
2. 将其直接分装成1ml/管,储存在-20℃。
3. 使用之前,先取出一管沸水浴至少5分钟,然后迅速放置