文档介绍：TNT荧光偏振免疫检测方法研究
陆文总基金辅助:西安工业大学校长基金(XAGDXJJ1014)
作者简介:陆文总(1979-),男,西安工业大学,博士,主要从事生物传感器研究。手机:**********。
*通讯作者:陆文总,wenzonglu@
,倪原,赵晨,张亮,任郁苗
(西安工业大学电信学院生物医学工程系,西安,710021)
摘要:(目的)本研究旨在利用新制备的多克隆抗体首次建立2,4,6-三硝基甲苯(TNT)的荧光偏振免疫分析方法。(方法)通过设计合成新的TNT半抗原TNT-BSA,偶联载体蛋白后免疫新西兰大白兔,制备亲和力高、特异性强的多克隆抗体。结合新设计合成的荧光示踪物TNT-PDAM建立了TNT的荧光偏振免疫分析方法。(结果)试验结果表明, μg/L,~ μg/L, μg/L。
关键词:TNT;荧光偏振;抗体;示踪物
(研究的重要意义)爆炸物原材料与恐怖主义分子活动的增加和环境的污染问题直接相关,海关、机场、车站等地方检查TNT(三硝基甲苯)等爆炸性物品是一件任务繁重、代价高的工作。爆炸性的硝基芳烃类化合物像2,4,6-三硝基甲苯(TNT)被世界各国用于各种军队装置和军需试验场,其残留物的环境监测方法也亟待发展。爆炸物危险性和可能的中毒量(≥2 ng/mL)需要检测时具备高灵敏性、低检测极限、迅速特性,对水环境和意外爆炸发生时的分析至关重要。(前人研究进展)目前实验室检测爆炸物的方法包括质谱[1]、表面增强拉曼光谱[2-3]、离子迁移光谱[4-5]、表面等离子共振[6-7]、分子印迹聚合物[8-9]、太赫兹光谱等[10]方法,这些方法检测硝基芳烃类化合物及其降解产物具有很高精确度和稳定性,但也存在检测时间长、前期处理繁琐、操作复杂、成本高等缺点,不易实现现场快速检测。(研究的切入点)硝基芳烃类化合物都是低分子量(<1 kDa),荧光偏振免疫法(FPIA)适合检测低分子量物质,而且不需要分离复合物和示踪物具有操作简单、成本低、选择特异性高和现场快速检测等优点。(研究拟解决的关键问题)本文通过设计合成高效的TNT人工抗原制备其多克隆抗体,同时设计合成其荧光示踪物,建立TNT荧光偏振检测方法,为爆炸物TNT分子的快速排查提供新的途径。
1 材料与方法
试验材料
紫外-可见分光光度计、多功能酶标仪、三硝基甲苯(TNT)、邻硝基甲苯、二硝基甲苯、三硝基苯酚、
***钠、吡啶、牛血清白蛋白(BSA)、1-芘基二氮杂甲烷(PDAM)、96-孔板、N-羟基琥珀酰亚***(NHS)、[1-乙基-(3-二***氨基丙基)碳酰二亚***](EDC)、弗氏完全佐剂与不完全佐剂、C18固相萃取柱,磷酸盐缓冲液(PBS,)用于示踪物、抗体、标准品的稀释,其它化学试剂均为分析纯。
半抗原合成
取TNT g,*** g, mL, 加入250 mL三颈瓶中,开动搅拌,通过滴液漏斗缓缓加入2 mL的浓硫酸,缓缓加热至80 ℃,保持温度不变, h至瓶中无晶体。自然冷却至室温, mL 10%的硫酸溶液,沸水浴十分钟,使三硝基苯甲酸钠完全转化为三硝基苯甲酸。再次过滤,得到淡浅黄