文档介绍：章晓联教授
武汉大学医学院免疫学系
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及应用
流式细胞术
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、
分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计
算机技术等学科高度发展、综合的结晶。
流式细胞仪的应用标志着细胞学、肿瘤学、免
疫学等进入了细胞和分子水平的研究.
一、流式细胞术的原理
流式细胞术(FCM, Flow Cytometry):是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性, 定量分析与分选的一门技术。
 
FCM是利用流式细胞仪(Flow Cytometer)分析在高压高速下通过样品孔径的单个细胞, 在激光束的照射下的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的荧光信号。
流式细胞仪与显微镜
FLOW MICROSCOPE
光源
激光
自然光、灯光、氙(汞)灯
对象
细胞、生物粒子
细胞、生物粒子
承载工具
载(盖)玻片
鞘液及流动室
检测信号
光学信号
形态及染色
放大方式
PMT,放大电路
目镜X物镜, 光学放大
统计
人工,200
计算机,>5000
结果
简单,单参数
多参数,综合分析
二样品的制备和数据的收集
流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮液, 凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的使用。全血或Ficoll-Hypaque分离的单核细胞, 用标记的单抗染色, 裂解红细胞然后在流式细胞仪上, 通过包被细胞的液流的鞘液进行分析。
流路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中
这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector
Tip
Fluorescence
signals
Focused laser
beam
Sheath
fluid
ATOM
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长, 流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长。
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号。
光路-荧光信号
常用荧光染料
FITC = fluorescein isothiocyanate(异硫氰酸呱荧光素)
PE = phycoerythrin (RD1)(藻红蛋白)
ECD = energy coupled dye(藻红蛋白-德州红)
PI = propidium iodide(碘化丙啶)
PC5 = phycoerythrin cyanin 5 (PeCy5)(藻红蛋白-花青苷5)
ultra-
violet
blue
gr
een
yellow
orange
red
infra-
violet
red
FITC
520
PE
575
ECD
615
PC5
665
LASER
488
PI
620
400-450 l
450-500 l
500-570 l
570-590 l
<390 l
590-620 l
620-750 l
>750 l