文档介绍：生物化学实验指导一、内容简介生物化学是一门课堂理论与实验技术相结合的专业基础课。实验主要以生物大分子制备的一般过程以及电泳和层析等生物化学技术为主,采用经典和现代分析技术相结合的实验方法和手段进行设计,实验内容既包含生物化学研究技术的基本方法,又反映生物化学研究技术的发展水平。开设实验为30学时,共有13个实验可供选择,其中验证性实验4个,综合设计实验9个。由三部分所组成:;、纯化、鉴定及含量测定;、分离及含量测定二、实验教学目标与基本要求通过本课程学习,使学生掌握常用的生物化学分析与制备技术,理解其基础理论,从而使学生增强对生物化学理论的感性认识,掌握有关生物科学研究的基本技术,并提高学生的动手能力。三、实验项目与学时分配序号实验项目学时备注验证性实验1唾液淀粉酶活性的观察3 任选二 2琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察33转氨酶的活性测定34脂肪酸的ß-氧化--酮体测定法3综合设计实验Ⅰ5血清IgG的分离制备--盐析法3   任选三  6凝胶层析法脱盐和分离蛋白质57DEAE-离子交换剂纯化血清IgG58聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定IgG纯度59紫外吸收法测定蛋白质含量2综合设计实验Ⅱ10动物组织中DNA的制备4  任选三 11琼脂糖凝胶电泳检测DNA412紫外吸收法测定DNA含量213脂肪含量及其碘值的测定3 四、实验内容实验1脂肪含量及其碘值的测定(一)、脂肪的定量测定原理脂肪类化合物一般都溶于有机溶剂(如乙醚、石油醚)而不溶于水或微溶于水,利用此特性,可以用索氏脂肪提取器抽提出样品中的脂肪。索氏脂肪提取器索氏(Soxhlet)脂肪提取器为一回馏装置,由浸提管,小烧瓶及冷凝管三者联接而成,浸提管两侧分别有虹吸管及通气管。盛有样品的滤纸包放在浸提管内,溶剂乙醚(或石油醚)盛于小烧瓶中,加热后,溶剂蒸汽经通气管至冷凝管,冷凝的溶剂滴入浸提管,浸提样品。浸提管内溶剂愈积愈多,当液面达到一定高度,溶剂及溶于溶剂中脂肪类物质经虹吸管流入小烧瓶。小烧瓶的溶剂由于受热而汽化,气体至冷凝管而滴入浸提管内,如此反复提取回馏,将样品中脂肪类物质提尽并带到小烧瓶中。最后将小烧瓶中的溶剂蒸去,烘干,小烧瓶的增重,就是样品中所含脂肪的量。因本法提取的物质,除中性脂肪外,还会有游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质,固提出的物质只能称粗脂肪。器材与试剂器材:天平,索氏脂肪提取管,恒温水浴锅,滤纸。试剂:乙醚(不含有过氧化物,乙醇及水分)沸点36℃。去过氧化物的处理:将乙醚装入分液漏斗,加入乙醚量1/5的10%硫酸亚铁(100克硫酸亚铁溶于600ml水中,再加30ml浓硫酸酸化,并稀释至1000ml),充分混合后,澄清分层,放出水液。过氧化物鉴定法:6ml乙醚于试管中,加2ml10%碘化钾溶液,猛烈混合,放置1分钟,下层碘化钾呈黄色,即表示有过氧化物存在。去乙醇的处理:加乙醚量1/5的10%氢氧化钾溶液洗涤,洗后放出水溶液,重复2-3次。去水分的处理:在乙醚瓶中加入适量细粒无水氯化钙,放置一昼夜,时加摇荡,将上层清液移入蒸馏瓶蒸馏。,103-105℃烘2小时至恒重,冷却后准确称重,并记录瓶重。(需研碎过40目筛孔)约2克,用滤纸包好,放入浸提管内,纸包长度不能超过虹吸管高度。-1/3体积的无水乙醚(其量应略大于浸提管内体积),联接索氏提取器各部分(不能涂凡士林)。置约70℃恒温水浴锅内(水必须是蒸馏水或置于电热板上)控制加热温度,使每小时回馏3-5次较宜,一般提取10小时左右。,待乙醚完全流入小烧瓶时取滤纸包,再回馏一次以洗涤浸提管。继续加热,待浸提管内乙醚面接近虹吸管上端而末流小烧瓶前,倒出浸提管中的乙醚,如果小烧瓶中尚留乙醚,则继续加热蒸发,直至小烧瓶中溶剂基本蒸完。停止加热,取下小烧瓶,用吹风机在通风橱中将瓶中残留乙醚吹尽。再置103-105℃烘箱中烘半小时,取出冷却后立即称重。:粗脂肪含量(%)=提取瓶的增重(g)/样品重量(g)×100注意事项乙醚为易燃品,切忌明火加热,同时要注意提取器各联接处有否漏气以及冷凝管效果是否良好,以免大量乙醚气外逸,使人麻醉。(二)、碘值的测定[原理]脂肪中的不饱和脂肪酸碳链上有不饱和键,可以吸收卤素(Cl2、Br2或I2)。不饱和键数目越多,吸收的卤素量也越多。每100克脂肪,在一定条件下,所吸收的碘的克数,设为该脂肪的碘值,即碘值愈高,不饱和脂肪酸的含量愈高。碘值是检定和鉴别油脂的一个重要常数,可以用来推算油、脂的定量组成。由于碘和脂肪的加成作用很慢,本实验采用汉诺斯(Hanus)溶液,它由碘与溴相混合产生IBr,溴化