文档介绍：编号:2-6主题:DNaseI足迹试验概述:DNaseI足迹法于1978年引入科研领域,其原理与DNA的化学测序法相似,首先将待测双链DN***段中一条链的一端选择性地进行标记,然后加入适当浓度的DNaseI,使在DNA链上形成缺口,经过变性后电泳分离,放射自显影,即形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。但当DN***段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合后,DNA结合蛋白可保护相应的DNA序列不受DNaseI的攻击,因此在放射自显影图谱上,DNA梯度条带在相应的DNA结合蛋白的结合区域中断,从而形成一空白区域,恰似蛋白质在DNA上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法。如果同时进行DNA化学测序,即可判断出结合序列的精确顺序,该技术至今仍然是最常用的方法,但是在实际应用中,首先应将序列特异蛋白进行一定程度的纯化,如硫酸铵分步沉淀,离子交换层析,凝胶过滤层析等,否则很难得到满意的结果。因此在该足迹法的基础上又发展了固相DNaseI足迹法,它具有如下优点:(1)采用生物素进行末端标记,避免放射性同位素的掺人,减少危害;(2)省略了有机抽提、沉淀等蛋白纯化步骤,操作简便,效率高;(3)使用范围广,可适用于未经纯化的核蛋白粗提物内特异性DNA结合蛋白的研究。DNaseI足迹法常与EMSA法结合共同用于体外DNA-蛋白质相互作用的鉴定,,而DNaseI足迹法在此基础上进一步证明了DNA元件和目标蛋白的特异结合,并能告知与该蛋白结合的相应DNA元件序列。目的:鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上的结合位点,找到与特异性DNA结合的目标蛋白,而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。原理:将含有特定顺式元件的双链DN***段进行单链单末端标记,与初步纯化的DNA结合蛋白