文档介绍：编号:3-2主题:凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)概述:凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。目的:;;;-footprinting。原理:通常将纯化的蛋白和细胞提取液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN***段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。步骤:使用Pierce生产的试剂盒,按照说明书操作。1、寡聚核苷酸的标记(1)冰上融化标记试剂盒所有试剂(TdT除外);(2)使用前,用lxTdTreactionbuffer稀释TdT贮液,工作浓度为2U/μl;(3)按下表加入试剂(总体积50μl):UltraPurewater25μl5xTdTReactionBuffer10μlSampleoligoDNA(lμl)5μl(finalconcentration100nM)Biotin-N4-CTP(5μl)5μl()DilutedTdT(2U/μl)5μl()(4)37C°30min;(5);(6)加50μl***仿:异戊醇(24:1)抽提TdT,剧烈震荡,高速离心,取上层水相;(7)检测标记效率。(8)互补连退火,退火后的用于EMSA分析或-20C°冻存。2、EMSA实验步骤(1)配制电泳胶:丙烯酰***的浓度为4-6%,100V电压预电泳;(2)结合反应按下列顺序加试剂(总体积20μl):UltraPurewaterdependent10xBindingBuffer2μlPoly(dIdC)lμlUnlabeledtagetDNAdependentProteinExtract3-5μgB