文档介绍：编号:3-3主题:染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)概述:真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DN***段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式作用因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。目的:研究体内蛋白质与DNA相互作用。原理:在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。步骤:一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)(10cm平皿),加入37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%;°孵育10min;;;;。二、除杂及抗体孵育(第一天),离心去除不溶物质;;不加抗体做为对照组;,跑电泳,检测超声破碎的效果;,加入ChIPDilutionBuffer和50×PIC再各加入ProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4C°