文档介绍：编号:2-5主题:Real-TimePCR概述:Real-TimePCR技术,又称实时定量荧光PCR(real-timequantitativePCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。Real-TimePCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。常用方法:SYBRgreen(荧光染料掺入法)和Taqmanprobe(探针法)。目的:用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。原理:(非特异性荧光标记):在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。(特异性荧光标记):PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。步骤:RNA抽提(以细胞样品为例,操作步骤同RT-PCR),PBS洗2遍,加入1mlTrizol,轻轻吹打,直至细胞脱落,,静置5min。(Trizol量根据细胞密度可适当调整,建议:6孔板细胞长满~1mlTrizol)***仿(三***甲烷),用手剧烈震荡15秒,室温静置2-3分钟。(***仿量为1/5Trizol),4℃,离心15min。,不能贪多,约400-500μl。,轻柔混合4~5次