文档介绍：免疫电泳的实验报告免疫电泳实验报告摘要:本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。关键词:抗体效价测定;火箭电泳;微量电泳;双向免疫扩散 1前言免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多,主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。其中比较常用方法有以下三种。火箭免疫,该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体,在电场的作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动,当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时,形成抗原体复合物而沉淀出来,走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动,在向前泳动过程中, 遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物,由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解,并一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合,有形成新的抗原抗体复合物沉淀出来,这样不断地沉淀—溶解—再沉淀,直到全部抗原与抗体结合,当比例合适时,可在短时间内出现锥形沉淀线,此沉淀线形似火箭,故称火箭电泳,抗原含量越高所形成的火箭峰愈长,因此依据火箭峰的长度,与标准抗原比较精确地计算抗原的浓。微量电泳,该方法的原理是不同蛋白质颗粒所带电荷不同,在同一电场中,因泳动速度不同而发生分离,用于抗原、抗体纯度测定,以及临床诊断。双向免疫扩散,根据出现沉淀线时抗体的最高稀释度来计算抗体的效价,或者依据沉淀线的出现定性抗原,检测疾病。 2材料与方法 ,抗原,巴比妥钠-HCl缓冲液,%琼脂糖凝胶,7%醋酸, 电泳仪,温箱,玻璃板,打孔器等。 -HCl缓冲液;制备%琼脂糖凝胶,煮沸至完全溶解;取琼脂糖凝胶约15ml,置55oC水浴中降温,并加入抗体200μL,共同孵育; 将二者混匀,铺火箭电泳板,放置冷凝倍比稀释抗原抗体;电泳板打孔(6孔),加入已稀释的抗原(约10μL/孔);电泳3~4h,电流:30mA/块,电压:100~120V;待火箭电泳结束,用%氨基黑染色10min,7%醋酸脱色至条带清晰。 Ag(x) 峰值兔抗鼠血清-20度冰箱中取出,实验时可能PBS稀释部分10倍巴比妥缓冲液琼脂凝胶:称取琼脂粉至250ml三角瓶中,加巴比妥50ml,沸水浴中溶解后,再加上述巴比妥缓冲液50ml,(混匀后置于4度冰箱保存备用) 免疫电泳技术将可溶性抗原与相应抗体混合,当两者比例合适并有电解质存在时,即有抗原-抗体复合物的出现,此为沉淀反应。如以琼脂凝胶为支持介质,则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡,可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量,免疫学的一些测定方法即基于此特性。抗原与抗体的结合在沉淀反应中,呈一定的分子比例。不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的,但只有在分子比例合适时,才出现可见的沉淀。所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。抗原结合多个抗体分子,称抗原为多价;抗体一般只能结合两个抗原分子的抗原决定法簇,故为二价。只有在彼此的结合价饱和时,才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。当抗原与抗体的比例合适时,即二者结合价彼此饱和,就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀,称为等价带。若比例不合适时,抗体或抗原过量,则虽有抗原、抗体的结合,但不能大量形成网状结构的大分子复合物,沉淀量很少,甚至不出现沉淀。在抗原、抗体数量关系曲线中,抗体过剩区域称为抗体过剩带,抗原过剩区域称为抗原过剩带。如图1所示,在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体,沉淀复合物就会有部分溶解,甚至全部溶解的现象。这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原,使网状大分子结构破坏,形成小分子复合物,致使沉淀出现溶解,沉淀量减少甚至完全消失。在沉淀反应中,由于抗原过量而不出现沉淀的现象,称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在,为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时,称为后带现象,同理需要稀释抗体进行检测。图1的位置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性,故其特异性高。这种结合也是相当稳定的。在一定条件下,二者可以分开,即结合是可逆的。解离后的抗原、抗体的活性一般保持不变。双向免疫扩散测定法原理双向扩散法(doublediffusion)又称琼脂扩散法,是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。(转载于:写论文网:免疫电泳的实验报告)琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构,大分子物质可以自由通过,这种分子的扩散作用可使分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇,形成抗原-抗体复合物,比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高,可直接观察到复合物的沉淀线。沉淀线的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小,分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、