文档介绍：兔子血凝实验报告血凝血抑试验一、1%红细胞准备:新鲜鸡抗凝血、PBS缓冲液或生理盐水、离心管、低速离心机步骤: 1、抗凝血第一次离心:1500rpm,5min。去除上层白细胞血浆等 2、加入PBS或生理盐水,颠倒混匀 3、第二次离心:1500rpm,5min。去除上层白细胞血浆等 4、第三次离心:XXrpm,10min。去除上层白细胞血浆等 5、99ml生理盐水或PBS+1ml红细胞。二、血凝物品准备: 待检测的样品、1%鸡红细胞、96孔血凝板、移液器及吸头、恒温箱试验步骤: 1、用PBS铺板:采用50微升体系进行试验。调节移液器至50微升,吸取PBS缓冲液加入96孔血凝板中,有几个样品就加几排孔。 2、倍比稀释:吸取50微升待检样品依次加入第1纵排孔中,吹打15下后吸取50微升再加入第2纵排孔,再吹打15下,吸取25微升加入第3纵排孔中,依次类推,直至第11纵排孔,吹打混匀后吸50微升后连同吸头一起弃去,第12纵排为红细胞对照。 3、加红细胞:加1%红细胞,每孔50微升,然后置于37℃温箱或者室温反应20-40分钟左右,读数即可。 4、读数时,以出现完全凝集的孔作为病毒的血凝滴度。三、4单位抗原 1、物品准备:病毒抗原、PBS缓冲液、1%鸡红细胞、单道和多道移液器及吸头、20ml青瓶及塞子、96孔微量血凝板 2、测定病毒滴度: 血凝,假设测得的血凝滴度为2的8次方,则四单位病毒的稀释倍数为2的6次方,即64倍稀释。3、计算抗原用量根据所需的四单位抗原的总量来确定抗原液的用量。比如,需四单位抗原总量为20ml,则利用公式:抗原原液*64=20ml,求出抗原原液的体积为,需要PBS缓冲液的体积约,根据计算的结果配置即可。 4、取PBS缓冲液,加入20ml的小青瓶中,取的病毒抗原液,加入到缓冲液中,盖上塞子,充分混匀,最好用涡旋仪混匀,至此,四单位抗原配制完成。四、血抑血凝试验(HA) 定义:某此病毒或病毒的血凝素,能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集,这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination,HA),也称直接血凝反应,利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA) 血凝抑制试验(HI) 定义:当病毒的悬液中先加入特异性抗体,且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素,则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制,称为红细胞凝集抑制(hemagglutinationinhibiion,HI)反应,也称血凝抑制反应,利用这种特性设计的试验称血凝试验(HI)。原理:特异性抗体与相应病毒结合,使病毒失去凝集红细胞的能力,从而抑制血凝现象。用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理,给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清,相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此,可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞,并且能被已知的抗血清所抑制,那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性,那么,这个未知病毒培养物就是新城疫病毒;如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞,但不能被鸡新城疫血清所抑制,说明不是鸡新城疫病毒,可能是其他有血凝性的病毒。阿氏液配制称量葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、***化钠,加蒸馏水至100mL,散热溶解后调pH值至,69kPa15min高压灭菌,4℃保存备用 1%鸡红细胞液的制备采血用注射器吸取阿氏液约1mL,取至少2只SPF鸡,采血约2~4mL,与阿氏液混合,放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500~1800r/min离心8分钟,弃上清液,沉淀物加入阿氏液,轻轻混合,再经1500~1800r/min离心8分钟,用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜,再重复2次以上过程后,加入阿氏液20mL,轻轻混合成红细胞悬液,4℃保存备用,不超过5天。 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞,在锥形刻度离心管中离心1500~1800r/min8分钟,弃去上清液,准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL),加入9倍体积(mL)的PBS,用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均匀。 1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL,加入9mLPBS,混合均匀即可。抗原血凝效价测定在微量反应板的1孔~12孔均加入25μLPBS,换滴头。吸取25μL病毒悬液加入第l孔,混匀。从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔,混匀后吸取25μL加入第3孔,如此进行对倍稀释至第11孔,从第11孔吸取25μL弃之,换滴头。每孔再加入25μLPBS。每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液振荡混匀,在室温下静置40min后观