文档介绍：分析谷胱甘肽作者:赵利娜,陶佳,赵运胜,廖飞【关键词】积分法;动力学酶法分析;还原型谷胱甘肽;谷胱甘肽摘要:目的以谷胱甘肽S转硫酶(GST)为模型,探讨有产物抑制时用积分法分析酶反应过程测定底物量的可靠性。方法从猪肝制备GST。1氯2,4二硝基苯(CDNB)终浓度为/L,监测GST催化还原型谷胱甘肽(GSH)与CDNB结合产物在340nm吸收变化。用积分法预测反应终点的产物吸收。结果优化产物抑制常数可使此积分法所得反应终点产物吸收对剩余底物变化不敏感。此积分法测定GSH对常见干扰有抗性。此法测定大鼠肝匀浆中外加GSH回收率大于98%,线性响应上限接近90μmol/L,下限接近μmol/L,所得大鼠肝GSH含量与文献报道一致。结论有产物抑制时用积分法也可定量底物;用此积分法进行动力学酶法分析具有一定普遍性,而且有明显优势。关键词:积分法;动力学酶法分析;还原型谷胱甘肽;谷胱甘肽S转硫酶;1氯2,ountofproductinhibition)ABSTRACT:icassayofsubstrateinthepresenceofproductinhibitionusingglutathioneStransferase(GST)(GSH)to1chloro2,4dinitrobenzene(CDNB)(finalconcentrationat/L),%withlinearresponserangedμmol/Lto0μmol/,:integratedmethod;icenzymaticanalysis;reducedglutathione;glutathioneStransferase;1chloro2,4dinitrobenzene还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)有重要生理功能[1]。用Ellman试剂(2,双(4硝基2羧基)二硫化物,DTNB)反应或高效液相层析(HPLC)可测定GSH[23],但巯基化合物对DTNB法干扰显著,HPLC定量GSH受到仪器和效率限制。测定谷胱甘肽S转硫酶(glutathioneStransferase,GST)催化GSH与1氯2,4二硝基苯(CDNB)结合产物的吸收也可定量GSH,此法简单易行,不受巯基化合物干扰[4]。但至今用GST测定GSH都用终点平衡法,其效率比动力学酶法分析低而成本高。本实验室建立的积分法,即用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线分析酶反应过程,可用于动力学酶法分析定量无产物抑制时不可逆酶反应体系的底物,其可测范围宽,抗干扰能力强[59]。但对存在产物抑制的复杂体系此积分法是否有效还未确定。GST反应存在明显产物抑制[10]。本实验用GST测定GSH为模型,考察此积分法用于有产物抑制的反应体系进行动力学酶法分析定量底物的可靠性,以明确此积分法用于酶法分析的通用性。 1材料与方法材料GSH、半胱氨酸、β巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2,2双(4硝基2羧基)二硫化物(DTNB)均购自Sigma公司,2,4二硝基氯苯(CDNB),磷酸纤维素P11购自Whatman,其余试剂为国产分析纯。方法 GST的制备操作均在4℃下进行。市售新鲜猪肝150g用/LTrisHCl缓冲液(,含250mmol/L蔗糖,/LEDTA,/LDTT)按1∶2匀浆;离心后上清用45%-85%硫酸铵分级;沉淀溶解透析后上磷酸纤维素