文档介绍：流感病毒寡核苷酸检测芯片的初步研究硕士研究生;徐秋林指导教师:马文丽教授郑文岭教授摘要流行性感冒是一种由流感病毒引起的上呼吸道传染病。流感极易在人群中传播并造成大流行。历史上每一次流感的大流行都会造成成千上万人死亡。流感病毒分为甲、乙、丙三型,甲型流感又包含�个血凝素亚型和�錾窬�彼崦�亚型。其中,常引起人群发病的是甲型流感病毒中的��和��以及乙型流感病毒。流感病毒基因为分节段的单负链���渲屑仔秃鸵倚桶��个��节段,丙型包含�鯮�节段,缺少神经氨酸酶节段。在这�鯮��诙沃校�编码核蛋白�������,��湍さ鞍��������琈�的节段具有型特异性,�还是流感病毒分型的依据;甲型流感病毒中血凝素�������,��和神经氨酸酶��������琋�极易变异,具有亚型特异性,是甲型流感病毒亚型划分的依据。目前流感病毒的检测方法主要有病毒分离法、血清学检测、流感病毒抗原检测和多重��觳夥椒āN蘼凼悄囊恢旨觳夥椒ǎ�嘉薹ㄍ�倍灾诙嘈秃脱切�的流感病毒进行精确的分型。因而有必要寻找一种高效、高通量和快速的流感病毒检测和分型方法。基因芯片技术的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。它可以同时对成千上万个基因进行检测,因而是一种高通量、平行化的检测方法。硕士学位论文
者相对简单易行,且系统的开放性较好。而在探针的长度的选择上,���墓�条���墓押塑账崽秸搿NA吮Vど杓频奶秸刖哂懈叨鹊奶匾煨院土槊舳龋�打印仪固定在玻片上。随后,从省��』氐募仔土鞲胁《局闔�������昙欠椒ǖ挠呕�静糠盅芯勘冉狭送ㄓ靡�锪:媳昙������基因芯片根据探针类型分为��芯片,��酒�凸押塑账嵝酒����来的研究表明,寡核苷酸芯片比��芯片和��酒�凶鸥�叩奶匾煨裕��时其灵敏度也能满足目前病原体检测的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用芯片上原位合成短的寡核苷酸探针的方法,也可以采用合成仪人工合成�~���墓押塑账崽秸肴缓蠊潭ㄔ谥С治锷系姆椒ㄖ票浮U饬街址椒ㄖ校��核苷酸探针被认为能取得特异性和灵敏度之间的平衡,并且多数情况下只需一个探针即可检测一个基因。本课题用���.�砑�攵粤鞲胁《镜腘�����蚇��蛏杓屏��设计时使探针�值在�±�嬷�洌珿��拷橛��ヒ灰��ィ�姨秸肽诓亢吞�针之间不易形成稳定的二级结构。在���榷灾校�肫渌��虻耐�葱孕∮��%,连续相同碱基的数量不超过�个。寡核苷酸探针合成和纯化后,用芯片和乙型流感病毒株中提取���孀B己笠韵拗菩韵允�������技术进行荧光标记后与芯片杂交,并根据杂交结果筛除与相应本型流感病毒样品的杂交信号的信噪比低于��约坝肫渌�土鞲胁《狙�吩咏坏男派け雀哂���的寡核苷酸探针,得到�条高灵敏度、高特异性的寡核苷酸探针。为了提高芯片的特异性和灵敏度,我们还对标记方法、片基和杂交条件等进行优化。����,��、�直接标记、�间接标记和随机引物逆转录标记这四种方法的标记效率和可重复性,将流感病毒��直鹩盟闹直昙欠椒ù�砗笥肓鞲胁�毒寡核苷酸检测芯片杂交,用���.�栽咏唤峁��蟹治觥=峁�砻鱑�方法在标记物杂交的荧光强度、信噪比、探针真阳性率和可重复性等方面均高于随机引物逆转录掺入标记法,而与其它两种�标记方法相当,但标记过程相对摘要����������
难≡癖静糠盅芯慷訡���⒍嗑劾蛋彼岚�坏腄��F�投�聚赖氨酸处理的显微镜载玻片这三种片基进行了评估。将荧光标记的绿色荧光蛋白�������珿���虻墓押塑账崽秸敕直鸫蛴≡谡馊�制�基上,并按常规方法进行洗脱,��������韬笥肎�����软件分析点的大小、荧光强度和背景荧光强度,以此来衡量�制��木�恍院凸潭ㄐ�率,并通过不同浓度梯度的���押塑账崽秸氲脑咏皇笛槔春饬科��栽咏�效率的影响。结果显示,�制��木�恍远冀虾茫�龆嗑劾蛋彼岚�坏腄��和���芯片的固定效率和杂交效率优于国产芯片。研究认为多聚赖氨酸包被的��片基性能优异,价格便宜,适合于大规模的基因芯片研究。��呕�咏晃露龋�咏皇奔浜驮咏灰旱忍跫�=峁�砻鳎�咏晃露���,杂交时间����咏灰汉��ゼ柞0罚�×���.���为流感病毒寡核苷酸芯片最适的杂交条件。��士匦酒�慕�ⅲ何A思嗖庑酒�觳獾墓�讨惺欠翊嬖谌宋5牟僮魇��以及降低芯片检测的假阳性率和假阴性率,研究中设计��押塑账崽秸胛Q�性对照探针,并构建了克隆有���虻目寺≡靥錑.�吞逋庾B荚靥錑—��以提供可掺入到��蛘逺�样品中与之一起标记的阳性对照品。该研究针对���蛏杓频�条���押塑账崽秸牒�条阳性对照探针通用引物串联序列与流感病毒寡核苷酸探针一起打印在��玻片上,并构建了���虻�克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的���虻腞�、��片段和人全血样品中的��肦�际趵┰霰昙牵�ū昙堑难�泛陀ü