文档介绍：浙江理工大学硕士学位论文摘 要前纤维蛋白是一种低分子量肌动蛋白结合蛋白,它的高级结构主要包括三个保守的结合域,分别为肌动蛋白结合结构域,多聚L一脯氨酸结合结构域和磷脂酰肌醇结合结构域,这三个结构域成为前纤维蛋白行使功能的基础。目前发现前纤维蛋白在一些细胞过程中如膜转运、小的GTPase信号途径、核内活性及神经发生及分化和肿瘤形成中起重要作用。广泛存在的前纤维蛋白与很多不同的配体相互作用,包括多聚磷脂酰肌醇、肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白及聚脯氨酸蛋白,前纤维蛋白可能通过特异的方式连接到不同的信号通路。我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得家蚕前纤维蛋白cDNA,命名为BmPFN,其开放阅读框长度381bp,编码由126个氨基酸残基组成的肽链。,。多序列比对结果显示其与赤拟谷盗(Triboliumcastaneum,鞘翅目)的前纤维蛋白同源性最高,126个氨基酸残基中有105个一致,同源性为83%。设计PCR引入EcoRI和NotI酶切位点,,。将重组质粒转入BL21(DE3)并诱导表达,,与预测的GST-profilin融合蛋白大小相符。。用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体效价为1:32000,用重组菌表达总蛋白做Westernblotting检测呈一条带。利用多克隆抗体对家蚕细胞Bm5进行亚细胞定位研究表明BmPFN主要分布于细胞质中。同时也进行了荧光定量PCR分析不同组织及发育时期该基因的表达差异,定量内参选用18SrRNA,结果显示在各组织中丝腺表达量最高,***表达量次之,脂肪体中的表达量最低;在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,幼虫的表达量最高,蛹次之,蛾中较少,卵中表达量最少。RNA干扰实验显示BmPFN在家蚕细胞正常的增殖中起重要作用。本论文第一次对家蚕的前纤维蛋白进行了克隆表达及功能的研究,为今后家蚕前纤维蛋白的研究创造了条件。关键词:前纤维蛋白;肌动蛋白;表达分析;.亚细胞定位;,whichareactinbindingdomain,poly-L-proline(PLP)stretchesbindingdomainandphosphatidylinostitolbindingdomain,andthethreedomainsarethefoundationofprofilin’,smallGTPasesignalingandnuclearactivities,inadditiontoneurologicalformationanddifferenciation,,includingphosphatidylinostitol,actin,actinrelatedproteins,,,,105of126aminoacidsareidentical,andthehomologyis83%.TheentireORFwasobtainedbyPCR,andEcoRI