文档介绍：碱裂解法提取质粒DNA实验目的1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。一、材料含pUC19质粒的大肠杆菌,,离心管架,枪头及盒、卫生纸。二、设备微量移液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,恒温水浴锅,双蒸水器,冰箱等。三、试剂准备1、LB液体培养基:称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800ml去离子水中,,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。(Ampicillin,Amp)母液:配成100mg/ml水溶液,-20℃保存备用。Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(),10mMEDTA()。1MTris-HCl(),()10ml,,加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min,贮存于4℃。Ⅱ:,1%SDS。2MNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,。5MKAc300ml,,加ddH2O至500ml。4℃保存备用。:10mMTris-HCl(),1mMEDTA()。1MTris-HCl()1ml,(),加ddH2O至100ml。121高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。1MTrisCl(Tris(三羟***)氨基甲烷):800mlH2O中溶解121gTris碱,用浓盐酸调pH值,混匀后加水到1L;(乙二***四乙酸):700mlH2O中溶解186