文档介绍：生命科学系2011-2012学年度分子生物学实验(0801班)2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 3实验二质粒DNA的转化 4实验三质粒DNA的提取 5实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA 7实验五PCR基因扩增 9实验六DNA重组 10实验七蓝白斑筛选实验 11实验八DNA酶切技术 13实验一大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的:掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术实验原理:感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料,在0℃、CaCl2低渗溶液处理,细胞壁破坏,细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。仪器::、..%甘油500mL(灭菌)实验操作步骤:从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落,接种于3mLLB液体培养基中,37℃振荡(200r/min)培养过夜。,37℃震荡培养2~3h.(~)将菌液置冰浴中10min。(、50%甘油预冷),4℃离心2min(3500r/min).弃上清,,4℃再离心一次,弃上清,倒置以便使培养液流尽。(轻轻涡旋使悬浮),立即置冰浴保温30min。4℃离心2min(3500r/min),弃上清,加入100µ、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮,置冰浴上,接着进行质粒DNA转化,或-70℃保存。实验二质粒DNA的转化实验目的:掌握质粒DNA的转化技术实验原理:DNA能够黏附于感受态细胞的表面,经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后,质粒DNA所携带的抗性基因(Ampr)得到表达,然后再在选择培养基上培养,使转化的菌株得以正常生长。仪器::LB培养基(液体、固体平板)、实验操作步骤:µL新鲜制备的感受态细胞,加入质粒DNA2µL(约5~50ng)混匀,冰上放置30min。同时做一对照试验:200µL感受态+2µL无菌水,其他操作同上述实验完全一样。℃水浴中,精确计时90秒。。:管中加入LB液体培养基800µL,37℃培养1h(50r/min):取200µL复苏细胞,涂布于含AMP的LB培养基上。待大约30min,让菌液被培养基吸收。:倒置平皿,37℃培养12~16h,转化子即可长成菌落。照相。实验三质粒DNA的提取一、实验目的:掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法二、实验原理  碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DN***段在拓扑学上的差异来分离它们。-,线状的DNA双螺旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。三、仪器、材料与试剂  (一)仪器          (二)材料与试剂 材料:带有pGEM-T质粒的大肠杆菌 试剂:1. SolutionI[50mmol/L葡萄糖,25mmol/(),10mmol/LEDTA()]2..  SolutionII(+2%SDS用前等体积汇合)3.  SolutionIII(5mol/L乙酸钾60mL,,)4.  TE缓冲液()[10mmol/(),1mmol/LEDTA()](EDTA)6.***仿:异戊醇(24:1):***仿:异戊醇(25:24:1体积比)8. RTE(含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液)  四、实验步骤1. 将3mL含Amp的LB液