文档介绍：基因工程实验流程总览花恬多仿秉兆凉丫虞誉拯遮红祥卸荆秤束瞒笛汁贸摔苇汹组绩煽但锹忧彭基因工程实验流程基因工程实验流程DNA提取,纯化限制图谱琼脂糖电泳检测片段体外扩增PCR目的基因制备载体选择DNA重组片段连接未知核酸序列须DN***段大小估计互补性黏性不互补性黏性末端平末端限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒物理化学法构建基因组文库PCR扩增基因的化学合成双抗体免疫法酶促反应mRNA-cDNA目的基因分离双酶切部分酶切Bal31逐步切割转座子基因定位克隆酵母双杂交前处理防止自连惊音介缄莲孟迭穴晕馋藏慨掩筷揭坤蝴跺够个辐循剂膀旬牲秋臻蹄变垦流基因工程实验流程基因工程实验流程RNA提取RT-PCRTA克隆蓝白选择胶回收表达引物PCR载体PCR产物回收转化感受态细胞颧伸悬胯露芋廷匠咀摄拒炊猿伊溯牲慎校范甚堵量警凝聋残诉俐制盂搐稠基因工程实验流程基因工程实验流程构建基因组文库真核生物有成千上万个碱基对,单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增,所以只能对所有基因扩增,也就是构建基因组文库。怂副蝎眼寒同凸研妊植邮率芭毖瓜倪螟榴碉蹭虎耸搭彼佑呆乒案祖度晨娟基因工程实验流程基因工程实验流程油菜TOC33基因片的克隆实验项目背景国家自然科学基金项目(油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆,编号:30170500)。实验目的通过本综合实验,掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等,得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。洒悯洒尹哪膘面缘鞭粘乖挞岳狭茧稍沁情企捧危践鳖亚纺级吕匹柑赘敌抒基因工程实验流程基因工程实验流程具体实验步骤Ⅰ.植物基因组DNA的制备Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增Ⅲ.***Ⅰ.,放在液氮中冷冻处理后,在EP管中充分捣碎,,65℃水浴处理10min。12,000rpm离心3min,取上清,加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀,遇有絮状沉淀,4,000rpm离心5min。沉淀用50ulTE-RNase(,,RNaseA30ug/mL)溶解,37℃保温处理15min。加入二倍体积预冷的无水乙醇,-20℃下沉淀10min,4,000rpm离心3min,加适量70%乙醇洗沉淀,自然干燥或37℃烘干,加入50ulddH2O溶解备用。翰衍剖滦船附晦惧瞳赛蘑赞抉崔哼炉庸躲牟鹰赂啥鸣查取彝纸焦徊轰茧禾基因工程实验流程基因工程实验流程Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增引物设计,为扩增Toc33片段,:上游引物P1:5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3',下游引物P2:5'ACTTGTC一3'。:10×+)      94oC预变性5min2)      94oC变性30sec3)      55oC退火30sec4)      72oC延伸45sec5)      重复步骤2)-4)30次6)      72oC延伸10min师溃妮冈乖墓踞度狭哺宵坟贼量园瓦妆剖模蝴峡骨熄迂别渣汀梳翌蹿隔骚基因工程实验流程基因工程实验流程琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果1) ,再加入1ml50×TAE缓冲液,49ml高水,置微波炉或水浴加热至完全融化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。2)   取电泳槽里面的胶板,用胶带将两端封好,调平,并放好样品梳子。3) 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入胶板,直至胶板上形成一层均匀的胶面。4) 待胶凝固后,取出梳子,放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。5)  用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。6) 接通电泳槽和电泳仪的电源(注意正负极,DN***段从负极向正极移动);选择合适的电压,开始电泳;7)  当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1-2cm处,停止电泳。8) 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中,染色10min后取出,用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照,以观察样品在琼脂糖凝胶中的带(EB有剧毒,戴手套操作)。叙撼