文档介绍：Fermentas分子克隆疑难问题解答指南默认分类2010-08-1011:28:32阅读72评论0字号:大中小订阅低产量或无转化子大肠杆菌感受态细胞转化效率低。(如pUC19,#SD0061)检测感受态细胞的转化效率。通常情况下,感受态细胞转化产量至少为1x106转化子/。电转化前未除去连接酶和/或PEG。电转化前,推荐采用***仿抽提方法纯化连接反应混合物。连接酶没有热失活。热失活连接酶可增加转化子产量。转化时连接混合物过量。每50pi感受态细胞最多可转化5…连接混合物。大肠杆菌无法忍受克隆的序列。检查目标序列是否含有大肠杆菌强启动子或其它可能的毒性元件和反向重复等。如果克隆基因表达产物对宿主有毒,需选择极低表达背景的启动子和使用低拷贝克隆载体。连接反应的连接酶过量。根据载体和外源片段的浓度,选择推荐用量的连接酶。为使操作更加简便,选择Fermentas公司提供的浓度为1u/pl的T4DNALigase(#EL0015)。。确保DNA无污染(如过量盐、EDTA、蛋白、酚等),否则会抑制连接效率。连接前建议凝胶纯化和/或酚/***仿抽提纯化载体和插入片段。凝胶切割回收时,DNA被UV光损害。凝胶切割回收DNA时请选用长波长的UV(360nm)光盒。如果使用短波长的(254-312nm)光盒,需缩短DNA在UV光下的曝光时间(几秒钟)。UV光照射时,需将凝胶置于玻璃或塑料平板上。此外,选择可见光染料可在普通光下观察标准琼脂糖凝胶中的DNA(1,2)o另一种避免UV光照射凝胶DNA的方法是样本在凝胶中上样两个或多个泳道,电泳后只切下一条泳道用溴化乙啶染色。染色的凝胶泳道作为切割未染色和未UV光照射的泳道DNA的参照物。DNA切割选用的限制酶不正确。载体和插入片段末端不匹配。重新检查克隆策略,选择可产生匹配末端的限制酶。载体和插入片段未磷酸化。如果载体是去磷酸化的,确保插入片段含有磷酸基团。PCR产物通常缺乏磷酸基团,连接前通常需经T4PolynucleotideKinase(#EK0031)处理使之磷酸化。CloneJET?PCRCloningKit(#K1231)对连接磷酸化和去磷酸化的DN***段都适合。DNA末端平端化效率低。根据DNA末端类型选择合适的平端化方法。DNA平端化操作方法和使用推。PCR产物切割效率低。引物中引入酶切和克隆所需的限制酶时,参考表“靠近PCR片段末端限制酶识别位点的切割效率”Y解有效酶切所需的PCR片段末端碱基数。切割前,除去PCR混合物中有活性的嗜热性DNA聚合酶。DNA聚合酶可能改变切割的DNA产物末端,从而降低连接产量。切割后,凝胶纯化PCR产物除去小片段DNA。小片段DNA在连接时与插入片段竞争。克隆用工具酶污染。克隆时选择最高质量的酶(如:L0-测试合格的工具酶)。要求酶蛋白分离物中无任何内切和外切核酸酶、磷酸酶污染。空载体(无插入片段)载体自身环化。连接反松前载体经FastAP?ThermosensitiveAlkalinePhosphatase(#EF0651)、CIAP(#EF0341)或SAP(#EF0511)去磷酸化处理。所有应用(如载体末端由于不匹配而不能自连)都推荐载体去磷酸化处理。去磷酸